单味与复方中草药提取物抑制镰刀菌的比较研究

关文超， 崔小珍， 杨 裕， 张 凯， 宋献艺

（山西省农业科学院饲料兽药研究所，山西太原 030031）

本研究针对多年来饲料及原料中玉米赤霉烯酮、雪腐镰刀菌烯酮检出率高，危害大的问题（龚阿琼等，2015；王金勇等，2012），追溯到主要产毒菌镰刀菌（Fusarium），选择其中最具代表性的禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）为供试菌株 （敖志刚，2009；刘江，1996），研究中草药提取物对其抑制效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试中草药 购自太原某大药房。

1.1.2 受试菌株 禾谷镰刀菌（2697）、串珠镰刀菌（2490）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂购于北京陆桥技术有限公司，马铃薯葡萄糖水购于广东环海微生物科技有限公司，按照产品说明配置。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药提取物制备 本试验采用水提法（丁振铎，2012）。原料100 g，部分原料需提前破碎或浸泡，加水1000 mL，煎煮2~3 h，4层纱布过滤药液；药渣加水1000 mL，煮沸后煎煮2~3 h，过滤药液；药渣再加水1000 mL，煮沸后煎煮1 h，合并3次煎液，静置12 h，滤取上清液文火浓缩，密度值为1.1~1.2，将药液倒入灭菌罐中，60℃以下低温喷雾干燥即得（关枫，2016）。所得提取物10~30 g。

1.2.2 菌种活化 禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌分别划线接种到PDA斜面培养基上，28℃培养，待斜面长满霉菌后，按相同方法划线接种到干净的PDA斜面培养基上，28℃培养5~7 d，使其充分活化。

1.2.3 药物培养基的配置 以一组药物需要培养基60 mL计算。称取提取物2.4 g，倒入无菌三角瓶，取15 mL无菌水稀释制成均匀药液，用移液管将培养基（PDA培养基制备时仅添加推荐水量的75%）43 mL与药液混合均匀注入平皿，制成药物含量为4%的平板静置备用。

1.2.4 抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法。用直径为5 mm的打孔器沿菌落边缘取菌饼，分别移至含药平板中央，有菌丝的一面朝下，每个处理3个重复，28.5℃培养。生长40 h后，十字交叉法测量菌落直径，记录数据，10~12 d对照组霉菌长满计算抑菌百分率（周永红等，2001）。

2 结果

2.1 单味中草药提取物抑制镰刀菌筛选 由表1可知，单味提取物抑菌效果最优为肉豆蔻，对串珠镰刀菌抑制率为63.42%，同时对禾谷镰刀菌也有良好的抑制作用。最终从26种中草药中筛选出六味对两种镰刀菌均有抑菌作用的中草药提取物，分别为肉豆蔻、黄芩、公丁香、诃子、石榴皮、五味子，其中五味子是在滤纸片筛选试验中显现出较好的抑菌效果而选定的。试验中空白组没有添加任何药物，对照组防霉剂1、2为市场销售的富马酸二甲酯和山梨酸钾，添加量为0.5‰和1‰（陈伟茹等，1998）。

2.2 两味中草药提取物配伍抑制镰刀菌效果将筛选出的六味中草药提取物按照1∶1的比例配伍组方，空白组没有添加任何药物，对照组防霉剂1、2、3是从规模饲料企业中随机取样的三种防霉剂，1为丙酸钙；2为复合型防霉剂，主要成分为丙酸、甲酸；3为克霉宝，主要成分为丙酸钠、二氧化硅。推荐用量分别为0.4‰、1.2‰、1‰，实际添加时均增加1倍。抑菌效果见表2。

供试浓度下，两味药物组方后，抑菌效果明显提高，1-5，1-3，3-6，1-2，1-6 对串珠镰刀菌的抑菌率超过55%，其中3种组方抑制率超过肉豆蔻单药抑菌活性，1-5即肉豆蔻-石榴皮组抑菌率达到70.55%。对禾谷镰刀菌的抑菌效果显示，上述五组复方药物的抑菌活性全部高于肉豆蔻单药抑菌率，效果最优组为1-6即肉豆蔻-五味子组。抑菌效果对比见图1、图2。

2.3 三味中草药提取物配伍抑制镰刀菌效果将筛选出的六味中草药的提取物按照1∶1∶1的比例配伍组方。抑菌效果见表3。

表1 单味中草药提取物对两种镰刀菌的抑菌效果

三味药物配伍后，所有配伍对串珠镰刀菌的抑制率均高于40%，其中10组复方药物抑菌率达到50%以上；对禾谷镰刀菌抑菌效果则更为显著，抑菌率达到70%以上共7组，其中1-2-5即肉豆蔻-诃子-石榴皮组抑菌率最优为77.91%，1-2-6即肉豆蔻-诃子-五味子组次之，抑菌率也超过77%。抑菌效果对比见图3、图4。

综合以上数据，在供试浓度下，肉豆蔻-石榴皮两药配伍对串珠镰刀菌抑菌作用最明显；三药组方对禾谷镰刀菌的抑制作用最强，肉豆蔻-诃子-石榴皮、肉豆蔻-诃子-五味子两个组抑菌率超过77%。

表2 两味中草药配伍对镰刀菌的抑菌效果

图1 单味药物与两药配伍抑制串珠镰刀菌效果对比图

图2 单味药物与两药配伍抑制禾谷镰刀菌效果对比图

表3 三味中草药配伍对镰刀菌的抑菌效果

图3单味药物与三药配伍抑制串珠镰刀菌效果对比图

图4 单味药物与三药配伍抑制禾谷镰刀菌效果对比图

3 讨论

本试验中肉豆蔻、诃子、石榴皮、五味子在单药抑菌和复方配伍中表现出了较好的的抑菌活性，其中肉豆蔻在六味组方药物中是抑菌率最高和成功组方最多的药物。

不同溶剂对不同植物的有效成分提取存在差异性（刘耀华，2015）。张海龙（2001）诃子化学成分提取试验表明，含有一定浓度盐酸的乙醇提取物具有更强的抗真菌作用；蔡小华等（2018）研究表明，诃子水提物抑制真菌作用最强；熊素英（2007）石榴皮抑菌液的制备试验显示，水、乙醇提取液具有抑菌活性，石油醚提取液没有抑菌活性，供试菌株中抑菌活性细菌>霉菌>酵母菌；本试验中石见穿、猫爪草水提物对禾谷镰刀菌没有抑菌活性，而王树桐 （2006）在禾谷镰刀菌抑菌试验中选择80%乙醇提取上述两药抑菌率均达到60%以上。本试验着重考虑水提物在饲料中添加的安全性和提取工作的便捷性，因此未针对不同药物选择不同的提取方法，一定程度上影响了部分药物的抑菌活性，还需今后不断完善。

中草药复方不是单味药物药效的简单累加，是体现性味归经、君臣佐使等配伍原则制成的一种特殊的化学药物整体。张卫红（2000）和顾芯等（1995）在混合制剂抑菌作用试验和食品防腐剂中草药复合剂的研制中均指出，中草药提取物之间存在抗菌性的协同增效作用，混合使用可提高抗菌效果，不仅降低了抑菌浓度，而且抗菌范围更为广泛。本试验中，对禾谷镰刀菌抑菌最优配伍为1-2-5，而不是单药抑菌率排名前三的组合，复方后较单药最优的肉豆蔻提高90%；对串珠镰刀菌抑制率最高配伍为1-5而非1-2，复方较单药最优的肉豆蔻提高11%，说明五味子、石榴皮、诃子等药物与肉豆蔻有协同作用，再一次证实中草药复方后的协同增效作用。其次，本研究中三方提取物组方对禾谷镰刀菌的抑菌作用最为明显，肉豆蔻-诃子-五味子组和肉豆蔻-诃子-五味子组抑菌率达到77%（见图5）。

图5 肉豆蔻单药和复方药物抑制禾谷镰刀菌效果对比图

4 小结

本试验在水提条件下，肉豆蔻单药抑菌作用最强，对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌抑制率分别为63.42%、40.89%；按照等量组方后，肉豆蔻-石榴皮对串珠镰刀菌抑制率达到70.55%，肉豆蔻-诃子-石榴皮、肉豆蔻-诃子-五味子对禾谷镰刀菌的抑菌率均超过77%，结果表明通过复方配伍可有效提高提取物对镰刀菌的抑制作用。