α-半乳糖苷酶及其在饲料中的应用

陈国参， 王佰涛， 徐文涛， 王一雯， 李寒冰， 刘德海

（1.河南省科学院生物研究所，河南郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

α-半乳糖苷酶，又叫蜜二糖酶（α-galactosidase，EC 3.2.1.22），可以催化不同半乳糖苷底物去除 α-1，6-连接的半乳糖残基（Naumov 等，2004）。大豆和其他豆类作为饲料当中丰富的蛋白质来源，其中含有高浓度的可溶性低聚糖如棉子糖和水苏糖等，其在动物胃肠道中不能被彻底消化，这些未消化完全的糖进入动物肠道后会促进有害菌群的增长，引起胀气和胃肠道紊乱，严重损害动物的健康，降低动物饲料的饲用效率。因此，在动物饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂可以将这些多余的糖彻底清除，抑制其在肠道中发酵，减轻动物胃肠道胀气症状，避免有害致病菌对动物肠道的损害，提高动物的免疫力，增加动物肠道对营养物质的吸收，提高饲料利用率（Ghazi等，2009）。

1 α-半乳糖苷酶的来源与分类

α-半乳糖苷酶在自然界中广泛存在，尤其在细菌、真菌、酵母菌等微生物中分布最广。α-半乳糖苷酶的细菌来源有嗜热芽孢杆菌 （Gote等，2006）、嗜酸乳酸杆菌（Fredslund 等，2011）、发酵乳杆菌 （Carrerasilva等，2006）、青春双歧杆菌（Kim 等，1999）、短双歧杆菌（Xiao 等，2000）等。另外从极端嗜热菌杜氏杆菌及海洋细菌假交替单胞菌也分离得到α-半乳糖苷酶 （Gomes等，2000）。据报道丝状放线菌当中也含有α-半乳糖苷酶，例如从重红色链丝菌和红色糖多孢菌中可分离得到α-半乳糖苷酶 （Post等，2005；Elshafei等，2001）。Brouns等（2006）从高酸度陆地火山地区发现的超嗜热古生菌硫磺矿硫化叶菌P2也可分离纯化得到α-半乳糖苷酶，这种α-半乳糖苷酶具有极高的热稳定性。此外，在真菌中，米曲霉（Shankar等，2007）、烟曲霉（Gurkok 等，2011）、藤仓赤霉（Mulimani等，1995）、简青霉（Luonteri等，1998）、嗜热棉毛菌（Puchart等，2000）及少孢根霉（Han 等，2003）均可作为α-半乳糖苷酶的来源。Wang（2014）等从费希新萨托菌中分离得到一种α-半乳糖苷酶，研究结果表明，其对豆制品具有高度专一的水解活性。

糖苷水解酶根据其氨基酸序列相似性，可将其分成135个家族，即GH-1~GH-135，α-半乳糖苷酶主要归属于其中五个糖苷水解酶 （GH）家族：GH-4、GH-27、GH-36、GH-57 和 GH-97。 其中GH-4家族酶和GH-57家族酶中α-半乳糖苷酶较少，一共只有八种酶具有α-半乳糖苷酶活性，且细菌来源居多。目前大多数已知的α-半乳糖苷酶都属于GH-27家族和GH-36家族。GH-27家族的α-半乳糖苷酶多来自于真核生物，例如：黑曲霉（Vries等，1999）；GH-36 家族酶多来自于原核生物，例如：嗜热脂肪芽孢杆菌（Fridjonsson等，1999）和嗜热栖热菌 （Fridjonsson等，2001）。同一种有机体中也可以包含GH-27家族和GH-36家族的α-半乳糖苷酶，例如：浅灰白链霉菌同时含有来自GH-27家族和GH-36家族的多种 α-半乳糖苷酶（Gherardini等，1985）。目前报道的GH-97家族中α-半乳糖苷酶非常少，其中多形拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶对钙离子具有高度依赖性（Okuyama等，2014）。

2 α-半乳糖苷酶的酶学特性

2.1 温度及pH对酶活性的影响 不同家族的α-半乳糖苷酶其分子量、最适pH及最适温度等差异较大。大多数α-半乳糖苷酶的分子量为45~400 ku，以单聚体或多聚体形式存在。大多数细菌α-半乳糖苷酶最适pH为6.0~7.5（Gherardini等，1985），真菌和酵母菌α-半乳糖苷酶最适pH为 3.5~5.5（Ulezlo等，1982）。 例如：链霉菌属 sp.S27来源的 α-半乳糖苷酶最适 pH为 7.4（Cao等，2010），费希新萨托菌来源的α-半乳糖苷酶最适 pH 为 4.5（Wang等，2014）；疏棉状嗜热丝孢菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH为4.6~4.8，在pH 4.0~7.0 酶活性稳定（Svastits等，2009）；毕赤酵母菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH为5.5，在pH 5.5~9.5酶活性稳定（Chen等，2015）。由于制糖过程中生产温度较高，要求一些α-半乳糖苷酶在较高温度下能够保持良好的稳定性及活性（Gherardini等，1985）。 例如：米赫根毛霉来源的α-半乳糖苷酶最适温度高达 55℃（Chen等，2015），疏棉状嗜热丝孢菌来源的α-半乳糖苷酶能够在温度60~66℃达到最优催化活性，在70℃能保持酶的稳定性（Svastits等，2009）。

2.2 金属离子和糖对酶活性的影响 众所周知，许多化学物质都会对α-半乳糖苷酶的活性造成影响。 例如：Hg2+、Ag+、Cu2+等阳离子对 α-半乳糖苷酶的活性具有显著的抑制效应，主要是因为其可与酶活性中心组氨酸上的氨基、羧基、巯基等基团发生反应（Gote等，2006）。一些研究报道表明，Mn2+、Mg2+、K+等能够对 α-半乳糖苷酶的活性产生活化效应，而大多数其他金属阳离子对α-半乳糖苷酶的活性没有影响或有抑制效应（Rezessyszab等，2007）。 Svastits等（2009）研究表明，从嗜热真菌中提取纯化的α-半乳糖苷酶能够被 Mn2+、Mg2+、K+显著活化，而 Hg2+、Ag+、Ca2+对其有显著的抑制效应。此外，α-半乳糖苷酶的活性还会受到一些糖及糖衍生物的影响，Gote等（2006）研究表明，当采用对硝基苯基-α-D-半乳糖苷作为反应底物时，半乳糖、蜜二糖、棉子糖及水苏糖都会对α-半乳糖苷酶的催化活性产生抑制作用，可能是因为这些化合物的半乳糖残基和对硝基苯基-α-D-半乳糖苷的半乳糖残基结构相似，因此可能会竞争酶的活性位点。Suzuki等（1970）报道，从葡酒色被孢霉中提取的α-半乳糖苷酶能够被D-葡萄糖非竞争性抑制，而Zapater等（1990）报道，从无花果曲霉中提取的α-半乳糖苷酶能够被甘露糖反竞争性抑制。

3 α-半乳糖苷酶的结构及催化特点

α-半乳糖苷酶主要由三个结构域组成，即N-端结构域、C-端结构域及催化结构域。不同GH家族来源的α-半乳糖苷酶结构有所不同，而α-半乳糖苷酶催化作用与酶的结构密切相关，不同糖苷酶家族的α-半乳糖苷酶催化特点不同。

GH-4家族酶包括三个保守残基，即酪氨酸残基、半胱氨酸残基和组氨酸残基，其在催化反应中可以螯合金属离子，半胱氨酸残基大多通过去质子化活化催化酶。GH-4家族糖苷酶属于构型保持酶，作为GH家族中一种特殊的水解酶，是唯一需要Mn2+等二价金属离子及NAD+同时作为辅助因子来参与催化反应的酶。此外，一些GH-4家族糖苷酶还需要还原剂二巯基苏糖醇及β-巯基乙醇的参与（Suresh 等，2002；Thompson 等，1998）。

GH-27家族酶和GH-36家族酶包含了已知的大多数α-半乳糖苷酶，且两个家族结构相近，二者的催化中心都是（β/α）8桶状结构，C-端结构域由β折叠股组成。GH-36家族酶与GH-27家族酶拥有相近的催化亲核体和质子供体，二者α-半乳糖苷酶的氨基酸序列中都存在保守序列 [LIVMFY]-x（2）-[LIVMFY]-x-[LIVM]-D-D-x-[WY]，并且发现其在GH-36家族的半乳糖苷酶中部附近，而GH-27家族则在氨基端附近（Fridjonsson 等，1999）。 D-D-x-[WY]是半乳糖苷酶的标志物，其中D是催化中心部分，起酸碱催化作用。Fujimoto等（2003）报道，通过多重同晶置换的方法在分辨率1.5 A条件下确定了GH-27家族大米α-半乳糖苷酶晶体结构模型。其主要包括N-端催化结构域及C-端结构域，N-端催化结构域构成了一个 （β/α）8桶状结构 （TIM桶状结构），C-端结构域由含有希腊钥匙关键基序的八个β折叠股（β夹层折叠）组成。

GH-57家族酶只包含极少数α-半乳糖苷酶，与GH-27及GH-36家族酶不同的是其对蜜二糖和水苏糖的水解能力较弱 （Lieshout等，2009）。GH-97家族酶包含两种构型的酶，即构型翻转酶α-葡萄糖苷酶（BtGH97a）及构型保持酶α-半乳糖苷酶（BtGH97b）（Okuyama 等，2009）。对BtGH97b的晶体结构分析和定点诱变研究结果表明，其结构包括N-端结构域、C-端结构域及催化中心，其中Asp415作为亲核催化剂，催化中心的Ca2+对于酶的催化作用十分关键 （Okuyama等，2014），其充当了路易斯酸的角色。Tracey等（2008）通过与EDTA孵育，发现孵育之后酶的活性大大降低，验证了GH-97家族α-半乳糖苷酶(BtGH97b)对于Ca2+的依赖性。

4 α-半乳糖苷酶的作用机理及应用

4.1 α-半乳糖苷的抗营养机理 如表1所示，不同植物种子中都含有不同含量的α-半乳糖苷，其中大豆和棉籽粕当中总α-半乳糖苷量最高，含量为5%~9%（Kuo等，1988）。 而这些α-半乳糖苷类进入肠道后，经过微生物发酵，转化成挥发性脂肪酸，能够产生二氧化碳和甲烷等气体，引起动物胃肠道胀气，使得动物进食减少，降低动物的生长速度。并且这些未消化的食物还会增加肠道食糜的渗透压，加快肠道对食糜的排空速度，从而降低动物对能量和蛋白质的摄取效率，对动物的生长产生负面影响。

4.2 α-半乳糖苷酶的作用机理 添加α-半乳糖苷酶后，可以加速降解α-半乳糖苷等抗营养因子，防止肠道微生物过度发酵，产生有害气体。同时α-半乳糖苷酶对糖苷的降解也能够防止致病菌在动物肠道上聚集，抑制有害致病菌对动物肠道的损害，提高动物的免疫力，避免在饲料当中使用抗生素。马慧慧等（2013）研究报道，在肉鸡饲料中添加α-半乳糖苷酶后，检测其血液生化指标及微生物菌群数量，结果发现肉鸡白蛋白含量显著升高，肠道有害菌群数量下降，有益菌群数量上升；此外，α-半乳糖苷酶可以破坏植物细胞细胞壁的完整性，促进细胞内蛋白质、淀粉等营养物质的释放，增加动物肠道对营养物质的吸收，提高饲料的利用效率。细胞壁作为植物细胞的重要组成部分，能够保持细胞内外的渗透压，而α-半乳糖苷酶可以破坏细胞壁降低动物肠道渗透压，避免水分在肠道滞留时间过长，减弱肠道内食糜的蠕动，促进营养物质的吸收。因此，通过在动物饲料中添加α-半乳糖苷酶能够促进动物对饲料更好的吸收利用。

表1 不同植物干种子中α-半乳糖苷的含量%

4.3 α-半乳糖苷酶在饲料中的应用 大豆在豆类当中营养价值最高，粗蛋白质含量高达30%~50%，大豆当中所含营养成分能够满足家禽和家畜对营养的需求。但是因大豆当中含有抗营养因子即糖苷类物质，造成大豆的利用率较低。研究表明，可以通过热乙醇提取法将这些糖苷类化合物从大豆当中提取出来，但是在提取过程中会破坏其中的氨基酸和免疫原性蛋白 （Coon等，1990），从而降低家禽和家畜的免疫力。因此在饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，糖苷类物质可以被内源性消化酶所降解，避免动物胃肠道不良反应，提升大豆的蛋白质生物利用度。

Baucells等（2016）在生长猪和肥育猪的饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，研究结果表明，与对照组相比试验组生长猪和肥育猪的体重明显增加，各项指标明显提升。Ghazi等（2003）在肉鸡大豆饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，结果表明，肉鸡对大豆饲料的消化效率提高，增加了大豆饲料的营养价值。蒋小丰等（2009）通过向约克纯种断奶仔猪的玉米大豆饲料中添加不同剂量的α-半乳糖苷酶制剂，分析其对断奶仔猪生产性能的影响，发现与对照组相比，加酶组仔猪生产性能和生化指标均有明显改善，对蛋白质利用率显著提高，同时增加了对粗纤维、粗蛋白质、粗脂肪的表观消化率。戴求仲等（2010）在饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂研究其对黄羽肉鸡生产性能的影响，结果表明，添加酶制剂后可以降解饲料中的α-半乳糖苷，改变肠道底物组成，促进有益菌的生长，抑制有害菌的生长，改善肉鸡生长状况，能够明显降低肉鸡后期和全期料重比，改善试验鸡生产性能。缪志军等（2010）在饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂研究其对番鸭增重和生产性能的影响，结果表明，其能够提高番鸭增重，改善生产性能。

5 结语与展望

α-半乳糖苷酶作为一种糖苷水解酶，在生产生活中应用广泛，尤其是在饲料领域应用前景较好，通过在动物饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，对动物饲料中存在的半乳糖苷等抗营养因子进行降解，可以改善动物胃肠道不良反应，促进动物对饲料中营养物质的利用效率，提高饲料的营养价值。但是α-半乳糖苷酶提取纯化工艺较复杂，热稳定性和酶活性不高，限制了其在生产中的应用，目前通过基因工程技术可以构建新型产α-半乳糖苷酶的工程菌，能够完成高效高活性生产α-半乳糖苷酶的任务，为该酶的开发利用打下坚实的基础，因此，α-半乳糖苷酶的开发潜力不容忽视。