不同乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌的抑制作用

刘丽娜，秦顺义，姚婉，赵方红

（天津农学院动物科学系，天津西青300384）

检测分析

不同乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌的抑制作用

刘丽娜，秦顺义*，姚婉，赵方红

（天津农学院动物科学系，天津西青300384）

本试验采用双培养平板法和刘振宇等（2005）的方法研究嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、口乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌生长、孢子萌发抑制效果的影响。结果表明，三种不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌的菌丝生长和孢子萌发具有较强的抑制作用，对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长的抑制率分别达到了30%，43%，65%；对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发的抑制率随着菌株培养时间的延长而逐渐升高。结果提示，三种乳酸菌对于玉蜀黍赤霉菌菌丝的生长、孢子萌发都有一定程度抑制作用，其中口乳杆菌的抑制效果最好。

嗜酸乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；口乳杆菌；玉蜀黍赤霉菌；抑制率

玉蜀黍赤霉（Gibberellazeae Schwein.Petch），其无性时期为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schwabe），是我国玉米赤霉病的主要致病菌（袁善奎等，2004），它主要污染谷物类（Proctor，1995），并且能够产生一些真菌毒素，对人和动物的健康造成一定的威胁（Marasas等，1984）。玉米赤霉烯酮是次级代谢产物，具有雌激素毒性、肝毒性、肾毒性以及基因毒性等，能引起动物流产、死胎、返情等生殖机能异常，还可以导致生长下降、免疫抑制、不育、畸形等（邓友田等，2007）。目前国内外玉米赤霉烯酮的去毒方法有物理方法、化学方法和生物学方法。虽然物理方法、化学方法在一定程度上可以降低玉米赤霉烯酮对人类造成的危害，但存在一定的局限性（蔡雨函，2012）。生物学方法由于利用微生物吸附毒素和代谢产物，具有安全、高效、无二次污染的特点（王宏祥等，2014；蔡雨函等，2012），成为当前的研究热点。

乳酸菌能够产生乳酸、抗菌素等物质，对玉米赤霉烯酮的生长及毒性产生一定的影响（张柏林等，2005）。近年来，乳酸菌对一些霉菌的抑制作用及相关抑菌机制也得到阐明（于向荣等，2013；郭艳萍等，2010）。本试验主要研究不同乳酸菌对玉米赤霉烯酮的拮抗效果，为研制高效、安全、无污染的玉米赤霉烯酮去除剂提供思路。

1　材料与方法

1.1材料菌种：玉蜀黍赤霉菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；乳酸菌株：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、口乳杆菌，实验室保存。

培养基：PDA琼脂培养基（北京索莱宝科技有限公司）。MRS液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水定容1000 mL，pH 6.8，121℃高压灭菌15 min，分装，待用。MRS固体培养基：MRS液体培养基加1.5%的琼脂，121℃高压灭菌15 min，冷却后倒入平板内置于4℃冰箱内待用。LB液体培养基：氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸馏水定容至1000 mL，121℃高压灭菌15 min，分装，待用。LB固体培养基：LB液体培养基中加入20 g的琼脂，121℃高压灭菌15 min，冷却后倒入平板内，置于4℃冰箱内待用。

1.2方法

1.2.1菌种的活化及纯化将冻存的嗜酸乳杆菌接种于MRS固体培养基中，然后将平皿用封口膜包好，以隔绝氧气，37℃培养48 h。48 h后挑取菌落继续划线培养，直至将细菌纯化。之后挑取菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃、120 r/min活化培养32 h，4℃冰箱保存。

将冻存的鼠李糖乳杆菌和口乳杆菌接种于LB固体培养基中，37℃培养24 h。24 h后，挑取菌落继续划线培养，直至将细菌纯化。之后挑取菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，120 r/min活化培养24 h，4℃冰箱内待用。

1.2.2玉蜀黍赤霉菌的培养在无菌的条件下，将保存于斜面中的菌种接种在PDA固体培养基中，于28℃培养5～7 d直至长出大量的菌丝。

1.2.3孢子悬液的制备将活化的玉蜀黍赤霉菌接种在PDA斜面培养基，28℃培养10 d，加入10 mL 0.05%吐温-80（V/V），然后用无菌纱布过滤除去菌丝，无菌水将孢子浓度调整到1×107cfu/mL，-20℃的条件下保存备用。

1.2.4乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长的影响乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长的抑制测定采用了双培养平板法：分别在PDA培养基内距中心3 cm处四个不同的位置接种乳酸菌液各10 μL，对照组以无菌水代替，于37℃培养1 d，随后在该培养基的正中央接种10 μL的孢子液，于28℃培养4 d后测量其直径。

1.2.5乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发的影响参照刘振宇（2015）的方法，将乳酸菌液与孢子液等体积混合，28℃培养，分别在12、18、24、36、48 h检查孢子的萌发状况，计算孢子萌发抑制率。用无菌水代替菌液为对照。

2　结果

2.1玉蜀黍赤霉菌的形态特征玉蜀黍赤霉菌在PDA培养基上生长5～7 d发现，玉蜀黍赤霉菌在培养基上产生大量气生菌丝，菌丝为白色，呈绒状。随着培养时间的延长，菌丝越来越旺盛，菌落基质从白色逐渐变为酒红色，其中有一部分是深红色。

2.2乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长抑制的影响由图1可见，嗜酸乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌生长的抑制率为30%，鼠李糖乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌生长的抑制率为43%，而口乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌生长的抑制率高达65%。表明三种不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝的生长有一定的抑制作用。

图1　不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌生长抑制的影响

2.3乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发抑制的影响由图2可见，嗜酸乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发的抑制率是随着培养时间的增加而逐渐增加的，但是在24～48 h时，上升趋势变缓慢；鼠李糖乳杆菌在培养12～24 h其孢子萌发抑制率基本呈直线上升，之后呈下降的趋势；口乳杆菌在培养12～48 h其孢子萌发抑制率基本呈直线上升的趋势。

图2　不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发抑制的影响

图2不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发抑制的影响

3　讨论

本试验主要是探究嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、口乳杆菌对玉蜀黍赤霉菌生长、孢子萌发抑制效果的影响。经试验得出，三种不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌的菌丝生长和孢子萌发均具有较强的抑制作用。目前，关于乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌拮抗的机理有：（1）乳酸菌的代谢产物对真菌菌株的抑制；（2）乳酸菌在生长过程中产生了抑制复合物；（3）真菌毒素与乳酸菌细胞壁之间的物理结合效果（张柏林等，2005）。

3.1乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长抑制的影响大量研究报道，乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝的生长有一定的抑制作用。乳酸菌通过形成有机酸或者产生抗菌物质，可以控制其他微生物的生长（张柏林等，2005）。在乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌菌丝生长抑制试验中发现各乳酸菌均对玉蜀黍赤霉菌菌丝的生长起到一定的抑制作用，但是嗜酸乳杆菌的抑制率较低，原因可能是嗜酸乳杆菌传代的次数过多，导致乳酸菌的表面性质或者其表面结构产生变化。

3.2乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发抑制的影响大量研究报道表明，乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发有一定的抑制作用。乳酸菌通过产生大量的过氧化氢对玉蜀黍赤霉菌的孢子萌发进行控制。Ponts等（2006）认为禾谷镰刀菌孢子萌发率可能受到了过氧化氢的影响。Dalié等（2010）认为孢子液与0.5 mol/L的过氧化氢一起培养会显著降低霉菌毒素，如单端孢霉烯。在乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发的抑制试验中发现各乳酸菌种均对玉蜀黍赤霉菌孢子萌发起到一定的抑制作用，但是嗜酸乳杆菌的抑制率较低，原因可能是嗜酸乳杆菌传代的次数过多，导致乳酸菌产生了极少量的过氧化氢。

4　结论

玉蜀黍赤霉菌广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、大麦等农作物及动物饲料中，经动物采食后会残留于畜产品中，导致肉、乳及其制品的污染，间接对人类健康造成重大危害。通过本试验研究发现，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、口乳杆菌三种不同的乳酸菌对玉蜀黍赤霉菌的菌丝生长和孢子萌发均具有较强的抑制作用，并且乳酸菌无毒无害，具有一定的保健功效，因此，研究结果为研制高效、安全、无污染的玉米赤霉烯酮去除剂提供了新思路。

［1］蔡雨函，胡延春，赵黑成，等.玉米赤霉烯酮的毒性及生物降解研究进展［J］.动物医学进展，2012，33（5）：102～105.

［2］邓友田，袁慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展［J］.动物医学进展，2007，28（2）：89～92.

［3］郭艳萍，盛海圆，陈晓琳，等.抑黄曲霉乳酸菌的筛选及菌种鉴定［J］.中国微生态学杂志，2010（7）：583～586.

［4］刘振宇，柳韶华，赵春青，等.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对桑炭疽病菌的抑制作用［J］.蚕业科学，2005，31（4）：409～412.

［5］王宏祥.富硒乳酸菌拮抗黄曲霉毒素对肉仔鸡毒性作用的研究［硕士学位论文］［D］.天津农学院，2014.

［6］于向荣，汤小宁，于清琴，等.乳酸菌抑霉菌菌株的筛选及应用［J］.齐鲁工业大学学报：自然科学版，2013，3：46～50.

［7］袁善奎，周明国.玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）对多菌灵的室内抗药突变体的诱导及其抗药性遗传分析［J］.遗传学报，2004，31（4）：363～368.

［8］张柏林，张若鸿，吴风亮，等.乳酸菌抗真菌活性及其抑制真菌毒素的效果［J］.中国乳品工业，2005，33（6）：31～37.

［9］Dalié D K D，Deschamps A M，Richard-Forget F.Lactic acid bacteria-Potential for control of mould growth and mycotoxins：A review［J］.Food control，2010，21（4）：370～380.

［10］Marasas W F O，Nelson P E，Toussoun T A.Toxigenic Fusarium species. Identity and mycotoxicology［M］.Pennsylvania State University，1984.

［11］Ponts N，Pinson-Gadais L，Verdal-Bonnin M N，et al.Accumulation of deoxynivalenol and its 15-acetylated form is significantly modulated by oxidative stress in liquid cultures of Fusarium graminearum［J］.FEMS Microbiology Letters，2006，258（1）：102～107.

［12］Proctor R H，Hohn T M，McCormick S P.Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichthecine toxin biosynthetic gene［J］. MPMI-Molecular Plant Microbe Interactions，1995，8（4）：593～601.■

The study was conducted to evaluate the effect of Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus oris on inhibiting the mycelia growth，spore germination of Gibberella zeae.Double culture plate and the method of Liu Zhenyu was used in this test.The results showed that three different kinds of lactic acid bacteria had strong antagonistic activity on the mycelia growth and spore germination.The inhibition percentage of three different kinds of lactic acid bacteria against the mycelia growth of Gibberella zeae reached by 30%，43%，65%，respectively.Inhibition percentage against the spore germination of Gibberella zeae gradually increased with the culture tmie prolonged.The results indicated that three different kinds of lactic acid bacteria had a certain degree of inhibition to the growth of Gibberella zeae，spore germination，the inhibition effect of Lactobacillus oris was the best.

Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus rhamnosus；Lactobacillus oris；Gibberella zeae；inhibition percentage

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161503

S816.7

A

1004-3314（2016）15-0013-03

国家自然科学基金项目（31101867）；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（15JCYBJC30600）