角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的工艺研究

郝鲁江，卢晓平，许艳蕊，范秋苹

（齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353）

科学实验研究

角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的工艺研究

郝鲁江*，卢晓平，许艳蕊，范秋苹

（齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353）

为研究角蛋白酶对羽毛蛋白粉的降解效果，采用不同的酶解温度、初始酶解液pH、酶添加量和酶解时间对羽毛蛋白粉进行酶解，并利用正交试验对酶解条件进行优化。结果表明：每克羽毛粉加入角蛋白酶0.03 g，酶解液初始pH为7，在35℃下酶解36 h。羽毛分解率达到50.5%，酶解液可溶性蛋白含量为225.7 mg/L，而酶解羽毛蛋白粉的胃蛋白酶体外消化率为23%，显示了角蛋白酶具有很好的酶解效果。

角蛋白酶；羽毛蛋白粉；可溶性蛋白；饲料

羽毛是家禽加工企业生产过程中产生的废弃物，直接丢弃不仅浪费了宝贵的蛋白质资源，同时也对环境造成了污染（陈循军，2008）。家禽羽毛含粗蛋白质85%～90%，其中90%是角蛋白，各种氨基酸总量在70%以上，且其中包含多种必需氨基酸，是一种良好的饲料蛋白来源（叶亚建，1997）。角蛋白的肽链是以α-螺旋和β-片层结构组成的，通过二硫键、氢键和其他交联键作用形成非常稳定的高度交联的三维结构（曾毅，2004）。因此寻找一种有效降解角蛋白的方法成为了开发利用家禽羽毛的基础。

本试验采用角蛋白酶对家禽羽毛进行酶解，并利用正交试验对酶解参数进行优化，以期获得最优工业条件，为家禽羽毛的工业化生产提供科学依据。

1　材料及方法

1.1材料与设备鸡羽毛，从家禽屠宰厂获得。角蛋白酶：100000 U/g（济南诺能生物工程有限公司）；1 mol/L NaOH溶液；1 mol/L HCL溶液；蒸馏水；考马斯亮蓝试剂（称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，加蒸馏水稀释至1000 mL）；蛋白质标准溶液（结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成100 μg/mL的蛋白质标准溶液）；胃蛋白酶（蛋白酶实际效价为1∶3000）。

立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI型，上海申安医疗器械厂）、恒温培养摇床（ZWY-240型，上海智诚分析仪器制造有限公司）、可见分光光度计（752型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司）、恒温干燥箱（DHG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司）、微量电子天平（AL104型，北京赛多利斯天平有限公司）等。

1.2试验方法

1.2.1羽毛的预处理及羽毛样品的制备从家禽场中获得的羽毛清洗后除杂，置于高压蒸汽灭菌锅中（121℃、40 min），80℃烘干12 h后粉碎，贮存备用（谢蓝华，2012）。

1.2.2可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595 nm，计算可溶性蛋白含量（μg/g）及羽毛分解率（%），绘制曲线。蛋白质含量的计算方法如下：

式中：W为由标准蛋白曲线上查得的蛋白质质量，μg；1.0为吸取提取液体积，mL；V为提取液总体积，mL；m为称取试样质量，g。

1.2.3酶解液中氨基酸成分的测定使用Biochrom（百康）30+全自动氨基酸分析仪对酶解液中含有的各种氨基酸进行分析。

1.2.4单因子试验确定最佳酶解条件取18个250 mL三角瓶，6个处理组，每组3个重复组，每瓶加100 mL蒸馏水和1g羽毛粉样品（符人源，2010）。

酶解温度试验：角蛋白酶添加量0.06 g，调节pH为7，酶解时间24 h，酶解温度分别为25、30、35、40、45℃，恒温摇床下反应。

酶解液初始pH试验：酶解温度以上次试验为参考，角蛋白酶添加量0.06 g，酶解时间24 h，酶解液pH分别为5、6、7、8、9、10，恒温摇床下反应。

酶添加量试验：酶解温度和pH以上次试验为参考，角蛋白酶添加量分别为0.01、0.015、0.02、0.03、0.045、0.06 g，恒温摇床下反应。

酶解时间试验：酶解温度、pH、酶添加量以上次试验为参考，酶解时间分别为4、8、14、23、38、46 h，恒温摇床下反应。

每组试验结束后，将酶解反应液过滤，取过滤液测定可溶性蛋白质含量，滤过残渣经烘干后称重待用。

1.2.5正交试验选取酶解温度、酶解液初始pH、酶添加量和酶解时间为观察因素，每个因素取五个水平，进行L25（54）正交试验（表1）。每次试验取3个250 mL三角瓶，都加入1 g羽毛粉样品和100 mL蒸馏水，相同条件重复3次。按照正交试验确定的最佳酶解参数进行酶降解试验。

1.2.6体外消化率的测定参照国标GB/T 17811-2008，采用酸性水中胃蛋白酶体外消化率的测定方法进行试验。

表1　优化复酶水解羽毛蛋白粉正交试验因素水平

试验方法步骤：称取1 g酶解羽毛粉残渣→添加胃蛋白酶（按样品1∶3000单位加入胃蛋白酶）→加入预热至45℃的酸性水100 mL→将三角瓶置于45℃恒温摇床中消化16 h→反应液过滤→烘干→称重。

1.2.7数据分析试验数据使用Excel软件进行分析计算，并对正交试验结果进行处理分析，计算得到R值、K值。根据R值的大小排序判断各因素对酶解效果的影响，根据得到的K值比较确定各因素的最适水平。

2　结果与分析

2.1蛋白质含量标准曲线由标准曲线（图1）获得蛋白质标准曲线方程为y=0.0049x+0.0897，R2= 0.9818，表明线性较好，该标准曲线可用。根据方程和测得的数据可以得到可溶性蛋白含量。

图1　蛋白质含量标准曲线

2.2单因子试验结果及分析

2.2.1酶解温度试验在不同温度条件下进行酶解羽毛粉试验。由图2可知，酶解温度为35℃时，酶解液中可溶性蛋白含量最高，随温度的升高或降低蛋白含量都降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最适温度为35℃。

图2　酶解温度对可溶性蛋白含量的影响

2.2.2酶解初始pH试验以酶解温度单因素试验确定的温度为参考，在不同pH条件下进行酶解羽毛粉试验，由图3可知，酶解液初始pH为7时酶解液中可溶性蛋白含量最高，随pH的升高或降低蛋白含量都降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最适初始pH为7。

图3　酶解初始pH对可溶性蛋白含量的影响

2.2.3酶添加量对可溶性蛋白含量的影响以试验确定的温度和pH为参考，在不同的酶添加量下进行酶解羽毛粉试验，由图4可知，随酶添加量的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当角蛋白酶添加量为0.03 g时，可溶性蛋白含量最高，达到165.4 mg/L。随着酶添加量的增加可溶性蛋白含量降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最适酶添加量为0.03 g。

图4　酶添加量对可溶性蛋白含量的影响

2.2.4酶解时间试验以试验确定的温度、pH和酶添加量为参考，在不同的酶解时间下进行试验，由图5可以看出，随酶解时间的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当酶解时间达到23 h时，可溶性蛋白含量为141.9 mg/L，随着酶解时间的增加可溶性蛋白含量减少，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最适酶解时间为23 h。

图5　酶解时间对可溶性蛋白含量的影响

2.3正交试验结果从表2中的极差可以看出，在一定的范围内，对羽毛粉降解影响最大的是酶解时间，其次是酶解液的初始pH、酶添加量，影响最小的是酶解温度。最优组合为A2B2C2D5，即酶解温度最适为35℃，最适的酶解液初始pH为7，角蛋白酶最适添加量为0.03 g，最适酶解时间为36 h，酶解液可溶性蛋白含量为225.7 mg/L。

2.4羽毛分解率在最适反应条件下酶解羽毛粉，酶解液过滤，残渣烘干后称重。在最佳酶解参数下，羽毛分解质量为505 mg，即羽毛的分解率达到50.5%。

2.5酶解羽毛粉体外消化率采用胃蛋白酶盐酸溶液进行体外消化率试验（GB/T 17811-2008），试验结果显示酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到了23%。

2.6酶解液氨基酸成分分析由表3可知，酶解液中含有较多的甘氨酸和苯丙氨酸，另外还含有9种常见氨基酸，表明该酶解液中氨基酸含量丰富，拥有良好的应用价值。

3　讨论

目前，制备生产羽毛蛋白粉的方法主要是高压水解法、化学水解法、膨化水解法以及酶法。国内大多采用的是高压加温水解法，此种方法虽然能够打开羽毛角蛋白中的二硫键，提高蛋白质在动物肠道中的降解率，但是会造成很多热敏性氨基酸的损失（汪国和，2005），而酶法具有良好的发展前景，高建新等（2007）研究酶解羽毛蛋白粉对蛋鸡生产性能的影响中发现蛋鸡日粮中用酶解羽毛粉代替部分植物蛋白饲料原料是经济可行的。

羽毛粉加工产品的营养价值取决于加工工艺，羽毛蛋白粉的处理方式不同会导致羽毛蛋白粉的利用率不同（Wang，1997），选用合理的加工工艺，能够充分释放出羽毛粉的营养成分并减少加工损失。刘家永等（2003）采用膨化-水解复合工艺制备可溶性羽毛蛋白粉，并用添加2%的可溶性羽毛蛋白来喂养家禽，结果表明可溶性蛋白在动物体内消化吸收率高达90%。Kim等（2002）采用化学与酶的方法评价了水解羽毛蛋白粉的效果，结果发现先用氢氧化钠做预处理，再用酶处理羽毛会提高胃蛋白酶消化率和体外氨基酸消化率。

相对于高压水解法和复酶酶解法处理加工蛋白粉，本方法能够降低成本，对设备要求较低，作用条件温和，酶解效果较好，为进一步开发利用家禽羽毛提供了科学依据。

表2　优化角蛋白酶水解羽毛蛋白粉正交试验结果与分析

4　结论

本研究得到的高温高压预处理与角蛋白酶降解羽毛粉的最适宜工艺条件为：鸡羽毛经121℃高温高压处理40 min，80℃烘干，粉碎、过筛，每克羽毛粉加入角蛋白酶0.03 g，酶解液初始pH为7，在35℃下酶解36 h，羽毛分解率达到50.5%，酶解液可溶性蛋白含量为225.7 mg/L，酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到23%，显示了具有很好的酶解效果，并且酶解上清液中可溶性蛋白含量较高。

表3　酶解液中氨基酸种类与含量mg/100 mL

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To research the degradation effects of keratinase on feather protein powder，different reaction temperature，initial hydrolyzate pH，enzyme dosage and hydrolysis time were studied by orthogonal test.The results suggested that the optimal condition was keratinase adding level of 0.03 g，hydrolyzate initial pH of 7 and at 35℃under enzymatic 36 h. Feather decomposition rate was 50.5%and the soluble protein hydrolyzate content was 225.7 mg/L，and enzymatic digestibility of the feather protein powder in vitro was 23%.It was concluded that the enzymatic hydrolysis effects of the keratinase on feather protein powder was good.

keratinase；feather protein；soluble protein；feed

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161501

S816.7

A

1004-3314（2016）15-0005-04

山东省自然科学基金（ZR2012CM019）