HPLC-DAD法检测饲料中多种农药残留

高林，高文惠*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050000）



检测分析

HPLC-DAD法检测饲料中多种农药残留

高林1，2，高文惠1，2*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050000）

本实验建立了同时分离检测饲料中三唑类杀菌剂（三唑酮、联苯三唑醇、烯唑醇）和菊酯类杀虫剂（胺菊酯、三氟氯氰菊酯、氰戊菊酯）的高效液相色谱（HPLC）-二极管阵列检测器（DAD）法。使用C18色谱柱，以甲醇和水为流动相，采用甲醇-水梯度洗脱，在被分析物最大吸收波长200～300 nm处对饲料中6种农药进行分离与检测。结果表明，6种农药在11 min内实现了基线分离，线性相关系数为0.9987～1.0000，检出限为0.01～0.05 μg/mL。样品平均加标回收率为83.5%～94.6%，相对标准偏差（RSDs）为1.51～3.81%（n=5）。可见该方法是高效、灵敏、快速检测饲料中农药残留的有效方法。

饲料；三唑类杀菌剂；菊酯类杀虫剂；二极管阵列检测器；高效液相色谱法

三唑类杀菌剂是指含有1，2，4-三唑环的化合物，主要用于防治植物病害，对病原微生物有杀死作用或抑制生长作用，因其高效、广谱、低毒以及长效性而广泛地应用于蔬菜、粮食等病虫害的防治（胡艳云等，2014；高文惠等，2013）。菊酯类农药也是目前广泛使用的一类杀虫剂，其毒性比有机磷农药低，但具有一定的毒性和蓄积性（Kelly等，2014）。常用的农药检测方法有超高效液相色谱-串联质谱法、固相萃取-高效液相色谱法、固相萃取-气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等（Arvand等，2013；王菲等，2013；胡静等，2012）。本实验利用二极管阵列检测器（DAD）的可变波长功能，结合溶剂梯度对常用的三唑类杀菌剂及菊酯类杀虫剂进行灵敏、快速的分离与检测。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂Waters 1525-2988高效液相色谱仪（美国沃特世科技有限公司）；756P紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LD-52A低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；SK5200LHC型超声波清洗器（上海科导超声器有限公司）；SZ-93自动双纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；PHS-3C型pH计（上海精密仪器有限公司雷磁仪器厂）。

甲醇，色谱纯，天津市康科德科技有限公司；实验用水为三蒸水。

标准品：三唑酮（97%，郑州绿康化工有限公司）；联苯三唑醇（99%，上海酶联生物科技有限公司）；烯唑醇（98%，北京金宝在线科技有限公司）；胺菊酯（95%，济宁天盛化工有限公司）；三氟氯氰菊酯（96%，济宁天盛化工有限公司）；氰戊菊酯（96%，济宁天盛化工有限公司）。

标准储备液的配制：分别准确称取三唑酮、联苯三唑醇、烯唑醇、胺菊酯、三氟氯氰菊酯和氰戊菊酯各150 mg，用甲醇溶解后分别定容于100 mL容量瓶中。

样品：鸡饲料、猪饲料、牛饲料，均为市售。

1.2样品处理称取5.00 g饲料样品，用30 mL甲醇提取（提取两次，每次15 mL），超声20 min，于4000 r/min离心10 min，合并2次上清液，定容至30 mL，混匀，取10 mL过0.45 μm微孔滤膜2次，超声脱气后备用（曹小妹等，2012）。

1.3色谱条件ele ofndard solution色谱柱Symmetry®C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水，梯度洗脱程序见表1；进样量：20 μL；柱温：30℃；检测波长范围：200～300 nm。

表1　梯度洗脱程序

2　结果与讨论

2.1检测波长的选择由图1可见，6种农药的最大吸收波长为194～221 nm，综合考虑各物质及流动相的紫外吸收情况，检测波长范围选定为200～300 nm。在该范围内，充分发挥DAD对被分析物提取最大吸收波长的功能，以提高检测灵敏度。

图1　6种农药的紫外光谱扫描图

2.2流动相的选择流动相的组成与配比对样品的分离效果和分析时间有很大影响。若以100%甲醇为流动相，6种农药不能实现分离，于是考虑向流动相中加入水。当甲醇∶水=90∶10（V/ V）时，6种物质的分离有所改善，但不能完全分离。当甲醇-水体积比为80∶20时，6种农药可实现完全分离，但是分离时间较长。因此，采用溶剂梯度洗脱方法（表1）。在最佳条件下6种农药混合标准溶液的色谱分离图如图2所示。由图2可以看出，各种物质色谱峰尖锐对称，分离效果好，分析速度快。

图2　混合标准溶液的分离色谱图

2.3线性关系和检出限取标准储备液配制成浓度为0.01～200 μg/mL的标准混合溶液，在1.3的色谱条件下测定，以峰面积对浓度绘制标准曲线，结果见表2。由表2可知，6种农药具有良好的线性相关性，其线性相关系数为0.9987～1.0000，检出限为0.01～0.05 μg/mL。由于有效地发挥了DAD的优势，与相关文献（高文惠等，2013；叶存玲等，2013；孟潇等，2013）比较，被分析农药的检测灵敏度明显提高。

表2　6种农药的线性关系及检出限

2.4样品测定饲料样品按照1.2中样品处理方法处理，在1.3色谱条件下进行测定。结果显示，在本实验被测定的饲料样品中未检出此6种农药，图3a和3b是典型鸡饲料样品和猪饲料样品色谱分离图。

2.5回收率和精密度实验针对鸡饲料、猪饲料、牛饲料样品分别在1 μg/mL和50 μg/mL 2个添加水平下进行加标回收率实验，结果见表3。其平均回收率（AR）为83.5%～94.6%，相对标准偏差（RSDs）为1.51～3.81%（n=5）。表明该方法回收率和精密度高，分析方法可行。

图3　饲料样品色谱分离图

表3　样品加标回收率和精密度（n=5）%

3　结论

本实验建立了HPLC-DAD法同时分离检测6种农药残留。6种农药在11 min内实现了基线分离，其线性相关系数r≥0.9987，检出限为0.01～0.05 μg/mL。样品平均加标回收率为83.5%～94.6%，相对标准偏差（RSDs）为1.51～3.81%（n= 5）。该方法灵敏、准确、简便、快速，可用于饲料及其他样品中多种农药的检测。

［1］曹小妹，王攀，张敬敬，等.毛细管胶束电动色谱法检测饲料中防腐剂［J］.中国饲料，2012，7：34～36.

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［5］孟潇，邵华，张志虎.高效液相色谱法测定尿中拟除虫菊酯及其代谢产物的方法研究［J］.中国辐射卫生，2013，22（2）：215～217.

［6］王菲，李彤，马辰.超高效液相色谱-串联质谱法测定中药材中三唑类杀菌剂及三嗪类除草剂的残留量［J］.色谱，2013，31（3）：191～199.

［7］叶存玲，伍心妮，刘珂珂，等.多壁碳纳米管固相萃取-高效液相色谱法测定水中三唑酮［J］.理化检验：化学分册，2013，9：1038～1041.

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［9］Kelly J T，Deborah H B，KIi C A，et al.Concentrations of the urinary pyrethroid metabolite 3-phenoxybenzoic acid in farm worker families in the MICASA study［J］.Environmental Research，2014，131：153～159.

A high performance liquid chromatography（HPLC）-diode array detector（DAD）method was developed for simultaneous determination of six pesticide residues in feed，including triazole fungicides（triadimefon，bitertanol and diniconazole）and pyrethroid insecticides（tetramethrin，cyhalothrin and fenvalerate）.Under gradient elution and maximum absorption wavelengths of the studied analytes within 200～300 nm，the six pesticides were separated by C18column with methanol and water as mobile phase，and detected by DAD.The results showed that complete separation of the six pesticides was achieved within 11min，the linear correlation coefficients were between 0.9987 and 1.0000，the detection limits were 0.01～0.05 μg/mL，the average spiked recoveries were between 83.5%and 94.6%，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 1.51～3.81%（n=5）.The method was efficient，sensitive and fast，it could be used to determine the pesticide residues in feed.

feed；triazolefungicide；pyrethroid insecticide；diodearray detector；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2016）06-0034-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160609

河北省科技计划项目（14227504D）；河北省食品药品监督管理局食品药品安全科技计划项目（ZD2015015）