响应面法优化野生酸枣仁中总黄酮的提取工艺

蔡雨晴，贾棹东，吴茜茜，白红进，2，蒋卉，2*

（1.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆化工重点实验室，新疆阿拉尔843300）



响应面法优化野生酸枣仁中总黄酮的提取工艺

蔡雨晴1，贾棹东1，吴茜茜1，白红进1，2，蒋卉1，2*

（1.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆化工重点实验室，新疆阿拉尔843300）

本试验采用响应面法优化超声波辅助提取野生酸枣仁中总黄酮的提取工艺。通过单因素试验考察了乙醇浓度、浸泡时间、超声温度和超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响，并在此基础上通过响应面法获得野生酸枣仁总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，野生酸枣仁总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度64.46%、浸泡时间12 h、超声时间44.02 min、超声温度62.86℃，在此工艺条件下酸枣仁总黄酮理论提取率为1.00984%，实际总黄酮提取率为0.9269%。

酸枣仁；总黄酮；超声波；响应面分析法

酸枣仁是鼠李科（Rhamnaceae）植物酸枣的种子，具有养心补肝、宁心安神、敛汗生津等功效，是较为常用的镇定安眠的中草药。酸枣仁中主要化学成分有多糖、黄酮、生物碱、皂苷、三萜、脂肪酸及氨基酸等化合物（张巧月等，2015；林海成等，2015）。李游（2009）研究认为，黄酮类物质为酸枣仁主要有效成分之一。

目前对酸枣仁总黄酮提取工艺的研究较少，且国内学者多采用正交设计和均匀设计来优化提取工艺（张吉祥和欧来良，2012；谷建等，2009）。由于这些方法本身的特点，一般采用线性数学模型拟合试验结果与影响因素间的关系，而不适合用二次多项式，试验次数较少，精密度较低，预测性比较差。响应面法是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程分析来寻求最优工艺参数，精密度和预测性较好，可信度较高。本试验在单因素试验基础上，用响应面法优化酸枣仁总黄酮的提取工艺，建立预测模型，旨在为酸枣仁总黄酮提取供理论基础和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器野生酸枣仁，于2014年11月采集于陕西省渭南市澄城县交道镇阿兰寨村。

芦丁标准品（纯度＞98%）；石油醚、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。

DHG-9145A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；LD500摇摆式中草药粉碎机（长沙市岳麓区常宏制药机械设备厂）；Sartorius-SQP电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；721-100紫外-可见分光光度计（上海菁华科技有限公司）；RE-50B旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；仪表恒温水浴锅（上海申光仪器仪表有限公）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；800型离心沉淀器（上海手术器械厂）。

1.2试验方法

1.2.1原料预处理将酸枣仁粉碎，过20目筛，称取一定量的酸枣仁粉置于索氏提取器中，用10倍体积的石油醚（60～90℃）、60℃水浴回流脱脂2次，每次回流3 h，并回收石油醚。将脱脂后的酸枣仁粉混匀后密封干燥保存。

1.2.2酸枣仁总黄酮含量的测定

1.2.2.1标准曲线的制作芦丁标准品溶液的制备：精密称取芦丁标准品12.00 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解，超声助溶，定容，得浓度为1.20 mg/mL芦丁溶液作为标准品母液。

参照刁海鹏等（2004）的方法，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法绘制芦丁标准曲线，以无水乙醇为空白对照，于波长510 nm测其吸光度。以芦丁标准液浓度（mg/mL）为横坐标（X），吸光度（A）为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

1.2.2.2样品中总黄酮提取率的测定供试样品溶液的制备：精确称取2.000 g酸枣仁粉，以乙醇浓度为60%，料液比为1∶25，浸泡时间为12 h，在超声功率为150 W，超声温度为60℃的条件下超声提取40 min，提取液以3000 r/min离心20 min，即得供试样品溶液。

取5 mL供试样品溶液于50 mL容量瓶中，按测定芦丁标准溶液吸光度的方法测定样品溶液吸光度，计算总黄酮提取率。计算公式（李游，2009）为：

式中：C为总黄酮提取液的质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；D为溶液稀释倍数；M为酸枣仁的质量，g。

1.2.3超声波辅助提取总黄酮单因素试验设计精确称取酸枣仁粉2.000 g，选择乙醇浓度0%、20%、40%、60%、80%、100%，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡时间4、8、12、16、20、24 h，超声时间10、20、30、40、50、60 min，超声温度30、40、50、60、70、80℃进行单因素试验，考察各个因素对酸枣仁总黄酮提取率的影响。

1.2.4响应面法优化酸枣仁总黄酮提取工艺在单因素试验结果基础上，运用Design-Expert软件，根据Box-Benhnken中心组合设计四因素三水平试验，以乙醇浓度、浸泡时间、超声温度、超声时间为自变量，酸枣仁总黄酮提取率为响应值设计响应面试验，因素和水平见表1。

表1　Box-Behnken试验因素与水平

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制标准曲线如图1所示。在0.06～3.0 mg/mL浓度时，吸光度（A）与标准品浓度（mg/mL）线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线

2.2单因素试验结果分析

2.2.1乙醇浓度对酸枣仁总黄酮提取率的影响在料液比为1∶20，浸泡时间为8 h，超声功率150 W，超声时间为40 min，超声温度为40℃的条件下，选取0%、20%、40%、60%、80%、100%乙醇考察乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，每个水平重复3次，不同乙醇浓度对酸枣仁总黄酮提取率的影响见图2。

图2　乙醇浓度对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的增加，酸枣仁总黄酮提取率逐渐增加，当乙醇浓度达到60%时，提取率达到峰值，然后随着乙醇浓度的增大，提取率逐渐下降，可能是由于乙醇浓度的增大影响了黄酮类化合物的溶解度，导致提取率下降，因此确定最佳乙醇浓度为60%。

2.2.2料液比对酸枣仁总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为60%，浸泡时间为8 h，超声功率为150 W，超声时间为40 min，超声温度为40℃的条件下，分别选取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，考察料液比对总黄酮提取率的影响，每个水平重复3次，不同料液比对酸枣仁总黄酮提取率的影响见图3。

图3　料液比对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图3可知，随着料液比的增加，酸枣仁总黄酮提取率逐渐增加，当料液比达到1∶25时，提取率达到峰值，然后随着料液比的增大提取率逐渐下降，因此确定最佳料液比为1∶25。

2.2.3浸泡时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为60%，料液比为1∶25，超声功率为150 W，超声时间为40 min，超声温度为40℃的条件下，浸泡时间分别选取4、8、12、16、20、24 h，考察不同浸泡时间对总黄酮提取率的影响，每个水平重复3次，不同浸泡时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响见图4所示。

图4　浸泡时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图4可知，随着浸泡时间的增加，酸枣仁总黄酮提取率逐渐增加，当浸泡时间达到12 h时，提取率达到峰值，然后随着浸泡时间的增大提取率逐渐下降，可能是因为长时间浸泡使黄酮类化合物氧化破坏，因此确定12 h为最佳浸泡时间。

2.2.4超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为60%，料液比为1∶25，浸泡时间为12 h，超声功率为150 W，超声温度为40℃的条件下，选取超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min，考察超声时间对总黄酮提取率的影响，每个水平重复3次，不同超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响见图5所示。

图5　超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图5可知，随着超声时间的延长，酸枣仁总黄酮提取率逐渐增加，当超声时间达到40 min时，提取率达到峰值，然后随着超声时间的增大提取率逐渐下降，可能是由于超声时间过长破坏了黄酮类化合物的结构，导致提取率下降，因此确定最佳超声时间为40 min.

2.2.5超声温度对酸枣仁总黄酮提取率的影响在乙醇浓度为60%，料液比为1∶25，浸泡时间为12 h，超声功率150 W，超声时间为40 min的条件下，选取30、40、50、60、70、80℃不同超声温度，考察温度对总黄酮提取率的影响，每个水平重复3次，不同超声温度对酸枣仁总黄酮提取率的影响见图6所示。

图6　超声温度对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图6可知，随着超声温度的增加，酸枣仁总黄酮提取率逐渐增加，当超声温度达到60℃时，提取率达到峰值，然后随着超声温度的增大提取率呈下降趋势，可能是温度影响了黄酮化合物的稳定性，因此确定60℃为最佳超声温度。

2.3响应面试验结果与分析综合单因素试验结果，固定料液比为1∶25，超声功率为150 W，选择4个重要的因素乙醇浓度、超声时间、超声温度、浸泡时间为自变量进行响应面优化试验，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2　响应面试验设计及结果

表3　响应面回归模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合，得到乙醇浓度（A）、浸泡时间（B）、超声时间（C）和超声温度（D）四因素三水平的二次多项回归模型方程为：

模型的可靠性可通过方差分析及相关系数来考察，模型相关系数R2=0.9611，说明该模型拟合较好，试验数值与预测值比较接近。由表3可知，模型F值为24.7226，P＜0.0001，说明该回归模型达到了极显著水平。失拟项P=0.5355＞0.05，说明失拟不显著，因而可以用该模型对酸枣仁总黄酮提取进行分析和预测。由回归模型和方差分析可知，方程交互项AB，二次项A2、D2对酸枣仁总黄酮提取率的影响达到极显著水平。根据F值可知，各因素对酸枣仁总黄酮提取率的影响大小顺序为：乙醇浓度（A）＞浸泡时间（D）＞超声时间（B）＞超声温度（C）。

图7～12为根据拟合模型绘制的酸枣仁总黄酮提取率的三维响应面和等高线图，等高线图可直观地反映各因素对酸枣仁总黄酮提取率的交互作用程度。由等高线可以直观的反映出各因素与对酸枣仁黄酮提取的影响。等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著，而呈椭圆形或马鞍形则表示两因素交互作用显著。由图7、10、11可以看出两因素的等高线呈马鞍形，表明乙醇浓度（A）与浸泡时间（D）、超声时间（B）与浸泡时间（D）、超声温度（C）与浸泡时间（D）两两交互作用显著。由响应面图可以看出乙醇浓度（A）对酸枣仁总黄酮提取率的影响最大，因为曲线最为陡峭。

利用Design-expertV 8.0.6统计软件对回归模型进行优化处理，得到超声波辅助提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺为：乙醇浓度64.46%，浸泡时间12 h，超声温度62.86℃，超声时间44.02 min，在此工艺条件下酸枣仁总黄酮理论提取率为1.00984%，实际总黄酮提取率为0.9269%。

图7　乙醇浓度、浸泡时间相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

图8　乙醇浓度、超声时间相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

图9　乙醇浓度、超声温度相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

图10　浸泡时间、超声时间相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

3　结论

本试验以脱脂后的酸枣仁为材料，采用超声波辅助提取其总黄酮，根据单因素试验结果，用Box-Benhnken设计响应面试验，建立了乙醇浓度、浸泡时间、超声温度和超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的回归模型，并对模型进行失拟，经过试验验证了该方法具有可信度，能够较好地预测酸枣仁总黄酮的提取率。得到超声波辅助提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺为：乙醇浓度64.46%，浸泡时间12 h，超声温度62.86℃，超声时间44.02 min，在此工艺条件下酸枣仁总黄酮提取率为1.00984%，实际操作得到酸枣仁总黄酮提取率为0.9269%。

图11　浸泡时间、超声温度相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

图12　超声时间、超声温度相互作用对总黄酮提取率影响响应面趋势图（a）和等高线（b）

［1］刁海鹏，吕俊杰，曹晓峰.蒲公英花中总黄酮含量测定［J］.山西医科大学学报，2004，35（2）：178～179.

［2］谷建，刘宇，梁剑平，等..均匀设计法优化超声提取黄花补血草中总黄酮［J］.中药材，2009，12（32）：1910～1912.

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The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen.The effects of ethanol concentration，soaking time，ultrasonic temperature，ultrasonic time and material to liquid ratio on extraction rate of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were examined，and on the basis，the optimum extraction technology was obtained via response surface methodology.The results showed that the best extraction conditions for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were as follows:ethanol concentration was 64.46%，soaking time was 12 h，ultrasonic time was 44.02 min，ultrasonic temperature was 62.86℃，the theoretic extraction rate for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen was 1.00984%，and the actual extraction rate was 0.9269%.

Zizyphi spinosi semen；total flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

中国·猪营养国际论坛

S816.7

A

1004-3314（2016）03-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160306

浙江大学馥莉食品研究院基金资助项目（KY201404）；国家大学生创新创业训练计划项目（201410757011）