植物黄酮作为饲料添加剂的安全性评价研究进展

东北农业大学动物营养研究所 冯香安 刘红南 刘莹 张琳 金芳 刘延国 李垚*

黄酮类化合物（flavonoids），又名生物类黄酮化合物（bioflavonoids），简称类黄酮，亦称维生素P，由于广泛存在植物中，又称植物黄酮类化合物；是一类重要的天然酚类化合物，属于植物次级代谢产物；泛指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，其基本骨架具有C6-C3-C6的特点，即由两个芳香环A和B，通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。根据其结构特点，可将黄酮类化合物分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、花色素、查尔酮、双黄酮等（Lwashina，2000）。由于黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血压以及预防心血管疾病和骨质疏松、治疗腹泻等功能，对动物的生产性能也有明显的促进作用，近年其研究与利用倍受关注。

本文综述了近年来国内外有关植物黄酮类化合物的安全评价研究进展，对安全合理地利用植物黄酮类化合物具有一定的指导意义。

1 植物黄酮类化合物的毒理学研究

1.1 一般毒性试验 外源化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应称为一般毒性（general toxicity），又称为基础毒性（basic toxicity），一般毒性研究主要揭示外源化学物与动物之间的量效关系，根据接触毒物的时间长短又分为急性毒性试验、亚慢性和慢性毒性试验。

1.1.1 急性毒性试验 急性毒性是指试验动物一次接触或24 h内多次接触某一化学物所引起的毒效应，甚至死亡。目的是了解受试物的毒性强度和性质，为蓄积毒性和亚急性毒性试验的剂量选择提供依据。致死剂量通常用半数致死剂量LD50来表示，其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数，即 mg/（kg·BW）。

大量急性毒性试验表明，植物黄酮类化合物在适当剂量下是无毒的。司红丽等（2003）在狗舌草总黄酮的提取及其毒性试验中测得狗舌草总黄酮的 LD50值为（1392.52±94.62） mg/（kg·BW），属于中等毒性，表明狗舌草总黄酮的毒性很低。李立等（2010）在大豆异黄酮复合胶囊毒理学安全性评价试验中采用最大耐受剂量法，剂量为10.0 g/（kg·BW），测得大豆异黄酮复合胶囊雌、雄小鼠经口急性毒性试验最大耐受剂量（MTD）＞10.0g/（kg·BW），属实际无毒级物质。虞颖映（2006）对罗布麻茶食品安全性的系统性毒理学试验研究结果表明，罗布麻叶提取物对试验动物大、小鼠的经口急性 LD50均大于 10.0 g/（kg·BW），属实际无毒级物质。唐浩国等（2007）在麻竹叶黄酮的毒理学试验中研究表明，竹叶总黄酮经口LD50＞21.50 g/（kg·BW），属实际无毒级物质。沈继红和张爱军（2006）在葡萄多酚的毒性试验中测得急性毒性半致死浓度为 LD50＞ 10 g/（kg·BW），属实际无毒级物质。隋海霞（2009）在芹菜素（又称芹黄素，是天然存在的一种黄酮类化合物）安全性和降血压作用及其机制的试验研究中测得大鼠经口急性毒性试验的 LD50＞ 8 g/（kg·BW）， 根据急性毒性试验结果分级，芹菜素属实际无毒级物质。Shoji等（2004）研究苹果多酚（apple polyphenol，AP）对大鼠的经口急性毒性，试验大鼠未表现不良症状，试验结果显示，AP的最小致死剂量大于2000 mg/（kg·BW）。 Féres等（2006）研究了巴西豆科植物DMB（Dimorphandra mollis Benth，DMB）的水醇提取物（含76%芦丁）对小鼠的急性毒性，试验小鼠有轻微可恢复的异常症状，结果显示DMB的水醇提取物的 LD50＞ 5000 mg/（kg·BW）。 Nagasako-Akazome 等（2007）对蛇麻素（lupulin）进行安全性评价，急性毒性试验显示2000 mg/kg剂量未引起大鼠的死亡，综合观测数据没有显著的统计学意义。通过这些急性毒性试验可以看出，这些植物黄酮类化合物在适当的剂量下是安全的。

1.1.2 亚慢性试验与慢性毒性试验 亚慢性毒性（也叫亚急性毒性试验）是指试验动物连续（通常1～3个月）重复染毒外源化学物所引起的毒性效应；慢性毒性是指试验动物长期染毒外源化学物所引起的毒性效应。目的是观察受试物以不同剂量水平较长期喂养对动物的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量。

在大豆异黄酮复合胶囊大鼠30 d喂养试验中，雌、雄性大鼠低、中、高剂量组的体重、进食量、食物利用率、脏器重量和脏器系数、血液生化和细胞学及病理组织学等各项指标与对照组比较差异均无统计学意义，说明大豆异黄酮复合胶囊在该剂量范围内是安全的（李立等，2010）。在对罗布麻茶食品安全性的系统性毒理学试验研究中，30 d短期喂养试验结果表明，其对试验动物的生长情况、血液学生化指标、主要脏体比及组织学皆无潜在的毒性作用（虞颖映，2006）。在葡萄多酚的毒性试验中对葡萄多酚样品喂养大鼠试验表明，30 d内大鼠生长发育良好，各试验组动物体重、体重增加，进行量、食物利用率、血常规、血生化以及脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性（沈继红和张爱军，2006）。在芹菜素安全性和降血压作用及其机制的试验研究中以0、2、4、6、8 g/kg 芹菜素喂饲大鼠 13 周，各剂量组体重、进食量、食物利用率、血常规、血生化以及脏器系数等各项指标与对照组比较，差异均无显著性（P ＞ 0.05）（隋海霞，2009）。 在研究 DMB 的水醇提取物对大鼠的180 d慢性毒性中，试验结果显示，1000 mg/kg剂量组没有任何临床反应，2000 mg/kg剂量组在试验初期有竖毛、活动减退等症状，4 d后症状消失，在试验第31～42天出现轻微变化如呼吸困难、疲劳、衰弱等，试验期间所有受试动物无一例死亡（Féres等，2006）。在进行蛇麻素（lupulin）的90 d亚慢性毒性试验中，临床评价没有发现明显的毒性效应，试验认为蛇麻素的无不良反应剂量（NOAEL）值为每天2000 mg/（kg·BW）（Nagasako-Akazome 等，2007）。 综合以上试验结果可知，植物黄酮类化合物在适当剂量下不会在长时间的饲喂中产生毒副作用。

1.2 蓄积毒性试验 外源化学物进入机体后，经过代谢转化排出体外，或直接排出体外。但是当其连续地、反复地进入机体，而且吸收速度超过代谢转化与排泄的速度时，化学物质在体内的量逐渐增加，称为化学物质的蓄积作用（accmulation）。外源化学物的蓄积作用是发生慢性毒性的基础。慢性毒性可以是因外源化学物或其代谢产物的物质蓄积，但有的化学物质，经长期接触后在机体内测不出该化学物质的原形或其代谢产物，可却出现了慢性毒性作用时，称之为损伤蓄积（也有称为功能蓄积）。根据有关规定如果LD50＞10 g/（kg·BW）者，则可不需要进行蓄积毒性试验（中华人民共和国卫生部，2004）。由急性毒性试验可知，多数植物黄酮类化合物的LD50都大于10 g/（kg·BW）。因此，蓄积毒性试验在植物黄酮类化合物的安全评价中很少见。

1.3 致突变性试验 致突变性（mutagenicaction）是指外来因素引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞分裂过程而传递。常用的检验化学致突变作用的试验主要有骨髓微核试验、精子畸形试验、染色体畸变试验、Ames试验等。

在大豆异黄酮复合胶囊毒理学安全性评价试验中进行Ames试验表明，各剂量组在加S-9或不加S-9条件下，均未引起回复突变菌落数明显增加，大豆异黄酮复合胶囊Ames试验结果为阴性；小鼠骨髓细胞微核试验表明，阳性对照组与溶剂对照组比较差异显著（P＜0.01），各剂量组微核率与溶剂对照组比较无显著差异（P＞0.05），小鼠骨髓细胞微核试验阴性；小鼠精子畸形试验表明阳性对照组精子畸形率与溶剂对照组比较差异显著（P＜0.01），大豆异黄酮复合胶囊各剂量组精子畸形率与溶剂对照组比较无显著差异（P＞0.05），小鼠精子畸形试验阴性（李立等，2010）。在对罗布麻茶食品安全性的系统性毒理学试验研究中进行小鼠骨髓细胞微核试验表明，样品各剂量组小鼠嗜多染红细胞微核率与阴性对照组比较，差异无统计学意义，即样品微核试验结果为阴性；精子畸形试验表明样品各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组相比较，经X2检验差异无统计学意义（P＞0.05）；而阳性组与阴性组比较差异有统计学意义（P＜0.01），即样品精子畸形试验结果为阴性（虞颖映，2006）。在麻竹叶黄酮的Ames试验结果中表明，麻竹叶黄酮的6个测试浓度在加S-9或不加 S-9活化的情况下，4个菌株 TA97、TA98、TA100和TA102的回变菌落数均与阴性对照组很接近，没有显著性差异（P＞0.05）且没有超过阴性对照组的2倍，而与阳性对照组比较要低得多，有极显著性差异（P＞0.01），因此，竹叶黄酮不能使鼠伤寒沙门氏菌移码突变株和碱基置换突变株发生回复突变的现象；竹叶黄酮的骨髓微核试验结果表明，阳性对照组（环磷酰胺）具有微核嗜多染色红细胞数与阴性对照组（竹叶黄酮0.00 g/kg）相比，差异极显著（P＜0.01），竹叶黄酮的各剂量组小鼠具有微核嗜多染红细胞率与阴性对照组相比，微核率值非常接近，无显著差异（P＞0.05），且无剂量-效量关系，因此，竹叶黄酮没有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应；竹叶黄酮的小鼠精子畸形试验结果表明，阳性对照组（环磷酰胺）小鼠精子畸形率与阴性对照组（竹叶黄酮 0.00 g/kg）相比，差异极显著（P ＜ 0.01）。竹叶黄酮的各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组相比，小鼠精子畸形率非常接近，无显著差异（P＞0.05），且无剂量-效量关系，揭示竹叶黄酮对小鼠精子的畸形无影响（唐浩国等，2007）。在葡萄多酚的毒性试验中进行Ames试验，结果表明该受试物各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数2倍，亦无剂量-反应关系，说明在加与不加S-9时受试样品对鼠伤寒沙门氏菌 TA97、TA98、TA100和TA102四株试验菌株均未出现遗传毒性，测试为阴性；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和精子畸形试验表明，各剂量组微核率、精子畸形率与阴性对照组相比，均无显著差异，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较，差异显著（P＜0.01）（沈继红等，2006）。在蛇麻素的研究中，Ames试验和微核试验结果均表明其无致突变性和遗传毒性（Nagasako-Akazome 等，2007）。 以上试验结果表明，植物类黄酮化合物在适当剂量下不会引起细胞核中的遗传物质发生改变，即无致突变性。

2 小结

综上所述，大部分毒理学研究提示植物黄酮类化合物一般无毒，但目前尚不完全清楚其作用机制，有必要对其展开系统研究，为植物黄酮类化合物的合理科学利用提供科学依据。植物黄酮类化合物在植物中广泛分布，利用我国丰富的植物资源从中提取具有多种生物活性和无毒的植物黄酮作为饲料添加剂，是安全可行的，并将具有广阔的前景。

[1]李立，王亚东，张焱，等.大豆异黄酮复合胶囊毒理学安全性评价[J].河南预防医学杂志，2010，21（1）：38 ～41.

[2]沈继红，张爱军.葡萄多酚的毒性试验[J].毒理学杂志，2006，20（2）：96 ～97.

[3]司红丽，王建华，王跃虎.狗舌草总黄酮的提取及其毒性试验[J].畜牧与兽医，2003，35（7）：9 ～10.

[4]隋海霞.芹菜素安全性和降血压作用及其机制的试验研究：[博士学位论文][D]北京：中国疾病预防控制中心，2009.

[5]唐浩国，魏晓霞，向进乐，等.麻竹叶黄酮的毒理学试验[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2408 ～2410.

[6]虞颖映.罗布麻茶对心血管系统的生物学效应及其安全性评价：[硕士学位论文][D]浙江：浙江大学，2006.

[7]中华人民共和国卫生部.GB/T15193-2003.食品安全毒理学评价程序和方法[S].北京：中国标准出版社，2004.

[8]Féres C A O，Madalosso R C，Rocha O A，et al.Acute and chronictoxicological studies of Dimorphandra mollis in experimental animals[J].J Ethnopharmacol，2006，108（3）：450 ～456.

[9]Lwashina T.The structure and distribution of the flavonoids in plants[J].J Plant Res，2000，113（3）：287 ～299.

[10]Nagasako-Akazome Y，Honma D，Tagashira M，et al.Safety evaluation of polyphenols extracted from hop bracts[J].Food Chem Toxicol，2007，45（8）：1383～1392.

[11]Shoji T，Akazome Y，Kanda T，et al.The toxicology and safety of apple polyphenol extract[J].Food Chem Toxicol，2004，42（6）：959 ～967.