白簕根皮乙酸乙酯部位镇痛抗炎及抗氧化活性研究

梁资就，蒋 林，林青华，林昌源，张仁义，黄小洪，赖信宏，谢孟姣，陈海燕，李芳婵

（广西中医药大学/广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室/广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200）

白簕［Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr］又名三加、白簕花、簕钩菜，是五加科五加属的攀援状灌木，在中国主要分布于广西、广东、云南、台湾等地［1］。现代研究表明，白簕主要含有黄酮类、酚类、多糖类、萜类、挥发油类等多种化学成分［2］，具有降血糖、抗炎镇痛、抗氧化、抗菌等多种生物活性［3］，临床可用于治疗肋间神经痛、风湿性关节肿痛、腰腿疼痛、跌打损伤等。白簕作为一种药食同源类植物，其嫩叶脆爽、清香，在南方地区常被作为蔬菜或茶叶使用，现已得到学者的广泛关注［4-6］。白簕的根或根皮入药称为三加皮，具有祛风除湿、清热解毒、散瘀止痛的功效，常用于治疗风湿痹痛、湿热痢疾、黄疸［7］。然而，关于白簕根或根皮的研究却并不充分，这不利于白簕药用价值的深入开发，故亟需对其化学成分、药理活性等方面进行系统研究。

广西中医药大学药学院课题组前期研究发现白簕根皮的乙酸乙酯部位（BLE）具有较好的生物活性，故本研究以白簕根皮乙酸乙酯部位（BLE）为研究对象，拟采用热板法、醋酸扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀模型、角叉菜胶致小鼠足肿胀模型及前列腺素E2（PGE2）炎症介质含量测定对其镇痛抗炎活性进行研究，并采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）法对其体外抗氧化能力进行评价，以期为白簕根皮的深入开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材及动物 白簕根皮购自广西玉林药材市场，经广西中医药大学朱意麟高级实验师鉴定为五加科五加属植物白簕的干燥根皮。SPF（无特定病原体动物，Specific pathogen free）级昆明种小鼠（20±2）g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK 桂2020-0003）。试验前动物适应性饲养3 d，动物试验获得了广西中医药大学实验动物伦理委员会的批准。

1.1.2 试剂和仪器

1）主要试剂。DPPH 自由基清除能力试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司，批号：G20220309G）；ABTS 自由基清除能力试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司，批号：G20220309G）；雷公藤多苷片（远大医药黄石飞云制药有限公司，批号：20201101）；维生素C 片（东北制药集团股份有限公司，批号：5210904）；吐温-80（药用辅料级，湖南尔康制药股份有限公司）；甲醇、冰醋酸、无水乙醇、氢氧化钾、二甲苯、角叉菜胶均为市售分析纯。

2）主要仪器。UV-1900i 型紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；1056310 型冷热板刺痛仪，北京众实迪创科技发展有限责任公司；H1650-W 型医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ5200B 型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；N-1300 型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；ME204 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白簕根皮乙酸乙酯部位溶液的制备 称取白簕根皮粗粉，加10 倍质量60%乙醇溶液回流提取2次，第一次2.0 h，第二次1.5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂，即得。动物试验前以2%吐温-80 将其制成悬浊液，备用。

1.2.2 热板致痛试验 参照文献报道方法［8-10］并略做改进：将热板测痛仪温度调节至（55±1）℃，将小鼠置于热板上，筛选出痛阈值在5～30 s 的小鼠进行试验。选取合格小鼠50 只，随机分为空白组（2%吐温-80 溶液）、雷公藤多苷片组（0.1 g/kg）和BLE 高剂量组（26.68 g/kg）、中剂量组（13.34 g/kg）、低剂量组（6.67 g/kg），每组10 只；测定小鼠基础痛阈值后连续灌胃给药7 d，每天2 次，分别于末次给药30、60、90 min 后测定小鼠的痛阈值。

1.2.3 醋酸扭体试验 参照文献报道的方法［11］并略做改进，动物分组及给药方法同“1.2.2”，末次给药30 min 后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液，5 min后观察并记录小鼠15 min 内的扭体次数，按式（1）计算。

1.2.4 二甲苯致耳肿胀小鼠模型试验 参考刘婧等［8］的方法并略做改进：动物分组及给药方法同“1.2.2”，末次给药1 h 后，在小鼠右耳廓内外两面均匀涂抹0.05 mL 二甲苯，左耳不涂，30 min 后处死小鼠，沿小鼠耳根部剪下小鼠两耳，用直径6 mm 的打孔器在左右耳相同位置冲下圆形耳片，称重，分别按式（2）和式（3）计算耳肿胀度（mg）和耳肿胀抑制率（%）。

1.2.5 角叉菜胶致小鼠足肿胀模型试验及PGE2炎症介质含量测定 参考文献报道方法［12］并略做改进：动物分组及给药方法同“1.2.2”，末次给药30 min 后，在小鼠右后足趾中部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.03 mL，建立足肿胀模型；4 h 后处死动物，剪取小鼠右后足及左后足，分别称重，分别按式（4）和式（5）计算足肿胀度和足肿胀抑制率。将小鼠右后足充分剪碎置于2 mL 生理盐水中浸泡2 h 后，于12 000 r/min 离心15 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mol/L 的氢氧化钾甲醇溶液1.5 mL，置于50 ℃水浴反应20 min，取出放凉至室温，加2.5 mL 甲醇溶液稀释，于278 nm 处测定吸光度（A），以吸光度作为PGE2含量，并按式（6）计算炎症抑制率。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的测定 参考文献报道的方法［13，14］并略做改进。取150 μL 不同浓度的BLE 溶液（0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL，溶剂为80%甲醇溶液）与150 μL 的DPPH 自由基溶液（按试剂盒说明书配制）置于EP 管中，混匀，室温下避光反应30 min，取200 μL 置于96 孔板中，于517 nm 处测定吸光度，记做A样品，按上述方法用等量80%代替DPPH 测定相应样品，所得吸光度记作A对照，按上述方法用等量80%甲醇溶液代替样品溶液进行测定，所得吸光度记作A空白，同时以维生素C 片为阳性对照。每组重复测定3 次，按式（7）计算清除率，绘制清除率曲线，计算IC50。

1.2.7 ABTS 自由基清除能力的测定 参考文献报道的方法［15，16］并略做改进。取10 μL 不同浓度的BLE 溶液（浓度同“1.2.6”）和190 μL 的ABTS 自由基溶液（按试剂盒说明书配制）置于96 孔板中，室温避光反应6 min，于734 nm 处测定吸光度，记作A样品，按上述方法用等量无水乙醇代替ABTS 溶液测定相应样品，所得吸光度记作A对照，按上述方法用等量无水乙醇代替样品溶液进行测定，所得吸光度记作A空白，同时以维生素C 片为阳性对照。每组重复测定3次，按式（7）计算清除率，绘制清除率曲线，计算IC50。

1.2.8 数据处理 数据采用SPSS 21.0 软件和Excel 2010 软件进行处理，试验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 认为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 热板致痛的试验结果

由表1 可知，与空白组相比，BLE 溶液各剂量组和雷公藤多苷片组在60 min 时痛阈值均有显著或极显著提高；与给药前相比，除90 min 低剂量组外，BLE 各剂量组和雷公藤多苷片组在各时间点的痛阈值均有显著或极显著提高，且各剂量组与雷公藤多苷片组相比，在各时间点均无显著性差异。结果表明，BLE 溶液各剂量组均具有类似雷公藤多苷片组的镇痛效果，其中尤以高剂量组为佳。

2.2 醋酸扭体的试验结果

由表2 可知，与空白组相比，BLE 溶液各剂量组和雷公藤多苷片组均能极显著减少小鼠醋酸扭体次数，明显提高对小鼠疼痛的抑制率，且各剂量组的剂量与对疼痛的抑制率呈正相关。结果表明，BLE 溶液各剂量组对醋酸诱发的小鼠疼痛具有良好的抑制作用，且与雷公藤多苷有不一样的疼痛抑制效果。

表2 BLE 溶液对小鼠醋酸扭体的影响

2.3 二甲苯致耳肿胀小鼠模型的试验结果

由表3 可知，与空白组相比，BLE 溶液各剂量组和雷公藤多苷片组均能显著或极显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀度，且雷公藤多苷片组与各剂量组间无显著性差异；BLE 溶液各剂量组的剂量与炎症抑制率略呈负相关，低剂量组炎症抑制率稍高于雷公藤多苷片组。结果表明，BLE 溶液各剂量组均具有与雷公藤多苷片组类似的抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀的作用，低剂量组效果最优。

表3 BLE 溶液对二甲苯致耳肿胀小鼠模型的影响

2.4 对角叉菜胶致小鼠足肿胀的试验结果

由表4 可知，与空白组相比，BLE 溶液高剂量组和雷公藤多苷片组均能极显著降低角叉菜胶致小鼠足肿胀的肿胀度，两组间无显著差异，且高剂量组的炎症抑制率高于雷公藤多苷片组。结果表明，BLE溶液高剂量组抑制角叉菜胶致小鼠足肿胀的作用与雷公藤多苷片组作用相当，但中、低剂量组抑制效果不明显。

表4 BLE 溶液对角叉菜胶致小鼠足肿胀模型的影响

2.5 PGE2炎症介质含量的测定结果

由表5 可知，与空白组相比，BLE 溶液高、中剂量组和雷公藤多苷片组中PGE2的含量均极显著降低，且3 组间无显著差异，中剂量组对炎症介质PGE2的抑制率与雷公藤多苷片组较为接近。结果表明，BLE 溶液高、中剂量组抑制PGE2炎症介质的效果与雷公藤多苷片组类似。

表5 BLE 溶液对PGE2炎症介质的影响

2.6 BLE 溶液对DPPH 自由基清除能力的影响

如图1 所示，当药液浓度低于0.15 mg/mL 时，BLE 溶液和维生素C 的浓度与DPPH 自由基清除率呈正相关，且BLE 溶液的作用效果优于维生素C；经计算，BLE 溶液与维生素C 的IC50分别为0.029、0.040 mg/mL。结果表明，BLE 溶液清除DPPH 自由基的能力强于维生素C。

图1 BLE 溶液对DPPH 自由基的清除能力

2.7 BLE 溶液对ABTS 自由基清除能力的影响

如图2 所示，在浓度为0.02～0.20 mg/mL 时，BLE溶液和维生素C 的浓度与ABTS 自由基清除率呈正相关，经计算，BLE 溶液的IC50为0.033 mg/mL，维生素C 的IC50为0.042 mg/mL。结果表明，BLE 溶液对ABTS 自由基的清除能力与维生素C 相当。

图2 BLE 溶液对ABTS 自由基清除能力的影响

3 讨论

疼痛是临床上由外伤或疾病引起的常见症状，缓解疼痛的药物可分为中枢性镇痛药和解热镇痛抗炎药两大类。中枢性镇痛药的镇痛效果与阿片受体有关，对急性疼痛有很好的缓解作用；解热镇痛抗炎药主要作用于外周神经系统发挥疗效，能够减少炎症所造成的疼痛［17］，雷公藤多苷片即为该类临床常用药，故本研究以此作为阳性药。热板致痛试验和醋酸扭体试验分别是研究急性疼痛和炎性疼痛的经典模型，本研究在热板致痛试验中发现，与空白组相比，BLE 溶液各剂量组在给药60 min 后具有与雷公藤多苷片相似的镇痛效果，且高剂量组镇痛效果可持续到90 min；在醋酸扭体试验中发现，BLE 溶液各组呈剂量依赖性的减少小鼠扭体次数，提高疼痛抑制率。由此推断，BLE 溶液有良好的镇痛效果。

炎症是机体对损伤刺激因子所产生的一种防御反应［18］，同时会产生大量的炎症介质，PGE2作为其中的一种炎症介质，在炎症发生的过程中发挥重要作用。本研究在通过二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀模型探讨BLE 溶液抗炎效果过程中发现，BLE 溶液各剂量均能有效抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀度，且效果与雷公藤多苷片相近；BLE溶液高剂量组对角叉菜胶引起小鼠足肿胀的抑制效果与雷公藤多苷片相当，且BLE 溶液高、中剂量组中PGE2含量显著降低。试验表明，BLE 溶液具有良好的抗炎效果。

自由基是生命过程中的代谢产物，其参与生命代谢的各个环节，机体自由基的产生与清除处于一种动态平衡中，若自由基过多且不能及时被清除，则会加速衰老，诱发各种疾病，甚至肿瘤［19］。本研究采用DPPH 法、ABTS 法评价BLE 溶液的抗氧化能力，结果表明，BLE 溶液对自由基的清除能力与浓度呈正相关，且抗氧化的能力相当或略优于维生素C。结果表明，BLE 溶液具有较好的体外抗氧化能力。

综上所述，白簕根皮乙酸乙酯部位有良好的镇痛抗炎和抗氧化活性，为白簕根皮深入开发研究提供了试验依据，同时，其镇痛抗炎的作用机制及其体内抗氧化能力仍需进一步研究。