棕黑锦蛇鳞片特征、脂肪酸和肌肉单糖分析

黄笑然，杨文建，万祥旭，周思宇，周宝丽，孟 鑫，金志民

（牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157011）

棕黑锦蛇（Elaphe schrenckii）是锦蛇属（Elaphe）动物，人工养殖条件下的棕黑锦蛇在观赏和食用方面具有较大经济价值。其鳞片特征、脂肪酸和单糖的组成与含量可以对棕黑锦蛇经济和保护价值进一步研究提供基础资料。相关学者对乌梢蛇及7 种常见蛇类混淆品的鳞片进行对比分析［1］，有研究采用GC-MS 法鉴定出尖吻蝮蛇（Spilotes pullatus）油中的20 种脂肪酸［2］，相关研究采用气相色谱法对微生物单糖、百合多糖和茶多糖样品中的单糖含量进行测定［3］，棕黑锦蛇鳞片形状颜色和数目种类具有明显特有的性状。脂肪中脂肪酸和肌肉中单糖的种类与相对含量也是其食用和药用价值的判断标准之一。棕黑锦蛇鳞片特征为蛇类混淆品鉴定提供基础资料，探究脂肪酸和单糖的种类与相对含量，对棕黑锦蛇食用和药用价值的研究进行一定补充，进一步明确棕黑锦蛇的保护意义和价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物为2021 年8 月于牡丹江市三道关林场道路上遭车辆碾压濒死的棕黑锦蛇。三道关林场（129°17′—129°35′E，44°41′—44°51′N）位于牡丹江市西北部，距市区24 km。

1.2 仪器与试剂

7890A 型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；SCIENTZ-10N 型冷冻干燥机，SB-5200DT 型数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-5286A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SteREO Discovery V8 型体视显微镜（德国ZEISS 公司）；MD-3500 型透析袋（北京翊博生物集团有限公司）；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖购自上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、95%乙醇溶液、氯化钠、氢氧化钠、甲醇、吡啶、三氟乙酸、三氯乙酸、盐酸羟胺、乙酸酐、正己烷、石油醚（30～60 ℃和60～90 ℃）均为市售分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 鳞片分析 将棕黑锦蛇头部表面用清洗液清洗干净后自然晾干。背部鳞片于超声波清洗器中清洗10 min，再用去离子水于超声波清洗器中清洗10 min，重复3 次，自然晾干；无水乙醇中浸泡3 h 对自然晾干后背部鳞片进行脱水，脱水后鳞片用2 片载玻片夹住，并用夹子夹紧以防止鳞片蜷缩。在解剖镜下对头部顶面、侧面和背部鳞片进行观察拍摄记录。

1.3.2 脂肪酸组成测定 称取40 g 脂肪组织研磨至匀浆，按料液比1∶10（g∶mL）加入正己烷与石油醚（沸程60～90 ℃）的混合溶剂（正己烷和石油醚体积比1∶1），采用超声波辅助提取法提取脂肪酸，超声功率为200 W，温度55 ℃，超声时间2 h。抽滤去除残渣，利用分液漏斗取上清液，经旋转蒸发仪（40 ℃）去除有机溶剂后利用分液漏斗取上清液，即为棕黑锦蛇粗蛇油。

甲酯化：取4～5 滴脂肪酸样品与2 mL 氢氧化钠-甲醇溶液（2 mol/L）充分振荡，沸水浴加热5 min，冷却至室温后加入2 mL 正己烷充分振荡，静置分层取上清液供气相色谱分析。

色谱条件：毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），载气为氮气，分流比100∶1，进样体积1 μL，进样口温度270 ℃，检测器温度280 ℃。初始温度100 ℃，10 ℃/min 升温至180 ℃，保持6 min，1 ℃/min 升温至200 ℃，保持20 min，4 ℃/min 升温至230 ℃，保持10.5 min。

1.3.3 单糖组成测定

1）粗多糖提取。取肌肉100 g 洗净沥干，研磨至匀浆，按料液比1∶2（g∶mL）加入正己烷和石油醚（沸程30～60 ℃）混合溶液（体积比1∶1），采用超声辅助提取法，30 ℃提取90 min，抽滤得残渣回收，重复2次。先后按料液比1∶2（g∶mL）加入生理盐水和NaOH 溶液匀浆后，30 ℃超声提取40 min，使粗多糖先后溶于生理盐水和NaOH 溶液，纱布过滤得上清液1 和上清液2，重复2 次。合并上清液1 和上清液2，70 ℃旋转蒸发，抽滤去杂，获得浓缩液，加入4 倍体积的95%乙醇溶液于4 ℃静置12 h 醇沉。醇沉后4 000 r/min 离心20 min，沉淀冷冻干燥后即为粗多糖。加入3%三氯乙酸溶液，搅拌至完全溶解，调节pH 至3.0，4 ℃过夜，4 500 r/min 离心10 min（沉淀即为蛋白质），将上清液即多糖溶液调节pH 至7.0，再重复此过程至无沉淀析出。70 ℃浓缩，多糖溶液透析24 h，冻干得精制多糖。

2）多糖水解。称取30 mg 棕黑锦蛇多糖于具塞试管，加入6 mL 的2 mol/L 三氟乙酸在105 ℃反应6 h，冷却至室温，70 ℃水浴浓缩至干。经1 mL 甲醇溶液溶解后70 ℃真空浓缩至干，重复3 次，获得多糖水解干燥品。

3）衍生物制备。称取3 mg 多糖水解干燥品（对照品单糖）加入10 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶，于具塞试管中90 ℃水浴30 min，水浴期间间歇混匀。室温冷却后加0.5 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，室温冷却后0.22 μm 滤膜过滤，获得棕黑锦蛇单糖衍生物。按照上述步骤但不加入单糖进行反应，所得溶液即为空白样品；9 种对照品单糖经衍生后各取100 μL 混合，即为混合对照品。

4）色谱条件。毛细管柱：（130 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氮气，分流比20∶1，进样体积1 μL，进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃。初始温度140 ℃，10 ℃/min 升温至240 ℃，保持10 min。

1.4 数据处理

使用Excel 软件对气相色谱数据预处理，Origin 2018 软件完成气相色谱图的绘制，预处理数据和色谱图对比确定标准品和样品间的对应，根据标准品鉴定棕黑锦蛇所含有脂肪酸和单糖的种类。

2 结果与分析

2.1 棕黑锦蛇鳞片特征

2.1.1 背鳞显微观察结果 图1 中，背部鳞片呈长菱形，有脊纹，左右对称，有椭圆形端窝2 个，端窝明显，靠近游离端。鳞片表面黄棕色。游离端狭尖，质地较厚，鳞片腹面有薄膜囊。鳞片表面有纵直的条纹，两侧有明显的乳头状凸起，分布区域窄长，基部边缘有指纹样横纹。

图1 棕黑锦蛇鳞片

2.1.2 头部鳞片对比 图2 中，棕黑锦蛇头长颈细，头背黑色，头腹黄色，背面与腹面交界处鳞片黑色和黄色交错，鳞片形状规则，分界线清晰。鼻鳞、颊鳞、眶上鳞、眶前鳞、眶后鳞、颞鳞、上唇鳞均在蛇头两侧对称分布，总数目即为单侧鳞片数的2 倍；下唇鳞围绕蛇头下唇连续分布，以吻鳞正下方的下唇鳞为中心，两侧对称分布，数目为11+1+11。鳞片的长宽以蛇头背面纵向为长，横向为宽作为判断标准（表1）。

表1 棕黑锦蛇头部鳞片特征

图2 棕黑锦蛇头部鳞片

2.2 脂肪酸组成特征

将经过超声波辅助提取得到的棕黑锦蛇油脂经甲酯化反应后，采用气相色谱法进行脂肪酸组成分析。脂肪酸组成定性分析利用标准品进行对照，定量分析采用峰面积归一化法。棕黑锦蛇油脂脂肪酸气相色谱图如图3 所示，脂肪酸种类及相对含量如表2 所示。

表2 棕黑锦蛇蛇油中脂肪酸的种类及含量

图3 棕黑锦蛇脂肪酸样品气相色谱图

图3 中，棕黑锦蛇油脂中脂肪酸含量丰富，共检出15 种脂肪酸，以不饱和脂肪酸为主，十七碳一烯酸（C17∶1）、山嵛酸（C20∶0）未检测出，存在一定量的十四碳以下脂肪酸。饱和脂肪酸（SFA）豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、木焦油酸相对含量共有31.236%；不饱和脂肪酸（UFA）相对含量共有63.246%，其中单不饱和脂肪酸（MUFA）棕榈油酸、油酸、花生一烯酸、芥酸、神经酸相对含量占37.659%，多不饱和脂肪酸（PUFA）亚油酸、亚麻酸、花生二烯酸、二十二碳二烯酸相对含量占25.587%，UFA 与SFA 比值为2.02，UFA 占比较高。SFA 中棕榈酸（22.600%）含量最高，其次是硬脂酸（5.280%）和豆蔻酸（2.800%），UFA 中油酸（34.200%）和亚油酸（22.200%）含量最高，其次是棕榈油酸（2.960%）和亚麻酸（2.950%）。

2.3 肌肉单糖组成气相色谱特征

图4 中，各单糖的保留时间依次为葡萄糖醛酸1.26 min、半乳糖醛酸2.13 min、鼠李糖4.29 min、阿拉伯糖4.49 min、木糖4.68 min、甘露糖7.55 min、葡萄糖7.73 min、半乳糖8.06 min、果糖11.94 min，将样品、空白对照、混合对照品的气相色谱图进行对比，通过保留时间判断棕黑锦蛇多糖样品在葡萄糖醛酸和葡萄糖处有吸收峰。其中葡萄糖吸收峰面积占69.13%，葡萄糖醛酸占14.32%，保留时间1.13 min和1.40 min 处的吸收峰因缺少标准品对照无法判断种类，峰面积各占8.51%和8.04%。依据空白谱图鉴定保留时间3.24 min 和4.19 min 处吸收峰不是由单糖引起形成的。

图4 棕黑锦蛇肌肉单糖气相色谱图

3 讨论

3 种锦蛇背部鳞片均为黄棕色，基部边缘有指纹样横纹，靠近游离端的椭圆形端窝和纵直条纹；黑眉锦蛇鳞片整体呈菱形或卵圆形，左右不对称，无脊纹；王锦蛇鳞片整体呈长椭圆形，游离端狭尖且质地较薄，鳞片腹面无薄膜囊［1］。同一属3 种锦蛇鳞片微观特征之间的差异，说明可以通过背部鳞片对蛇类混淆品进行鉴定。棕黑锦蛇的颊鳞、眶前鳞、眶后鳞数目与王锦蛇、百花锦蛇、红点锦蛇、双斑锦蛇相同［4-6］，吻鳞、鼻间鳞、额鳞、顶鳞的数目与黑眉锦蛇和王锦蛇相同［1］，说明头部鳞片也可以作为蛇类混淆品鉴定的依据。

棕黑锦蛇所测定的脂肪酸中油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸的相对含量较高，与乌梢蛇、缅甸蟒和中华眼镜蛇相同［7-9］。与棕黑锦蛇脂肪酸相对含量由大到小依次是油酸（34.200%）、棕榈酸（22.600%）、亚油酸（22.200%）、硬脂酸（5.280%）相比，乌梢蛇是油酸（41.360%）、棕榈酸（23.720%）、亚油酸（7.200%）、硬脂酸（7.140%），缅甸蟒是油酸（50.700%）、棕榈酸（22.100%）、亚油酸（9.800%）、硬脂酸（7.800%），中华眼镜蛇是油酸（39.420%）、棕榈酸（25.040%）、亚油酸（15.760%）、硬脂酸（11.190%）。虽然相对含量较高的脂肪酸种类相同，但是其中棕黑锦蛇油酸含量低于其他3 种蛇类，亚油酸含量高于其他3 种蛇类，而亚油酸是人体不能自身合成的必需脂肪酸，具有抗癌、抗糖尿病、降低血液和肝脏胆固醇与调节机体免疫力的作用。

本研究利用三氟乙酸水解、盐酸羟胺衍生并通过气相色谱分析测得棕黑锦蛇肌肉多糖由葡萄糖和葡萄糖醛酸组成。有研究利用三氟乙酸水解，通过高效液相色谱法分析皱纹盘鲍（Haliotis discus hannaiIno）肌肉多糖中单糖主要由葡萄糖组成［10］；也有研究利用木瓜蛋白酶酶解，通过高效液相色谱测定皱纹盘鲍腹足的粗多糖主要由葡萄糖和半乳糖2 种单糖组成［11］。这些结果不同于本研究中提取的多糖，可能与物种及多糖提取方法有关。棕黑锦蛇肌肉中测得的葡萄糖醛酸，能与许多体内外毒物及其代谢产物结合成无毒的葡萄糖醛酸结合物后排出体外，具有保肝护肝和排毒解毒的作用，还可用于关节炎和结缔组织疾病以及风湿性、类风湿性关节炎等的辅助治疗。

4 结论

本研究分析棕黑锦蛇头部和背部鳞片，测定油脂中脂肪酸和肌肉多糖中单糖的种类和相对含量，表明棕黑锦蛇头部鳞片数目和形态与背部鳞片的显微特征均能作为与其他蛇类混淆品鉴别的依据，蛇类鳞片间的特征差异对于蛇类鉴定有着一定的作用。脂肪酸以不饱和脂肪酸含量最大，其中亚油酸的相对含量较其他蛇类高，在药用方面具备一定的价值。肌肉多糖中测得的葡萄糖醛酸，可用于排毒护肝、辅助治疗关节炎，具有一定的研究价值。