微波辅助低共熔溶剂提取葡萄果渣中原花青素及其稳定性研究

付佳乐，耿 直，陈革豫

（陕西国际商贸学院医药学院，西安 712046）

葡萄作为传统的药食兼用植物，含有丰富的营养活性物质［1］，如原花青素、蛋白质、多种微量元素、维生素等［2］，其中原花青素含量最高，约占1/5。原花青素是一种多酚类化合物，广泛分布于黑枸杞、葡萄、银杏叶、玫瑰等草本植物中，是一种自然强抗氧化剂，能够提高人体的防御机能，有效保护人体细胞，清除自由基，同时能够改善皮肤，修复已经破损的细胞等功能［3-5］。葡萄果渣中富含花青素，但经常用作肥料或被丢弃，不但对环境造成污染，同时也浪费了资源［6］。

低共熔溶剂（DESs）在2003 年首次被提出，是一种离子溶液，由一定化学计量比例的氢键受体和氢键供体构成，具有溶解性强、制备简单、成本低、不易挥发、可进行生物降解等优点，极大程度地避免了对环境的污染，是近年来运用最广泛的绿色溶剂之一［7，8］。低共熔溶剂的物理性质可以通过配比加以调节，可以减小辅助配体和氢氧键供体含量的加入，通过对萃取温度的调节，以更大程度地增加提取含量。但低共熔溶剂目前仍处于待开发阶段，在原花青素的提取方面报道很少［9，10］。通过试验研究，以期为低共熔溶剂的开发提供一定的参考和借鉴，也为原花青素的保存提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

仪器与设备：UV1810 型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；PHS-25 型pH 计，上海伟业仪器厂；TGL-16B 型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；KY-MCR-3 型微电脑微波化学反应器，上海秋佐科学仪器有限公司。

材料与试剂：原花青素标椎品（HC89537），上海惠诚生物科技有限公司；葡萄果渣，陕西省咸阳市博惠种植合作社；氯化胆碱（含量98%，V62201125），山东优索化工科技有限公司；乙醇、甲醇、丙三醇、草酸、柠檬酸、氯化镁、维生素C、过氧化氢等均为分析纯，水为纯化水。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理 葡萄果渣烘干，粉碎，过40 目筛备用。

1.2.2 低共熔溶剂的制备 按照试验中处方比例，将不同的氢键供体同氯化胆碱进行化学计量融合，置锥形瓶中，80 ℃水浴加热40 min，静置，冷却至室温。

1.2.3 供试品溶液的制备

1）缓冲液的制备。将1.49%的KCl 溶液与1.7%的HCl 溶液按照体积比25∶67 混合，调节pH 至1.0±0.1［11］。

2）原花青素粗提液的制备。取“1.2.1”项下葡萄果渣细粉0.5 g 于锥形瓶中，加入低共熔溶剂，振摇后微波提取，提取液于3 800 r/min 离心10 min，上清液加缓冲溶液定容至25 mL，待用。

1.2.4 标准品溶液的配制 精密称定0.025 0 g 原花青素标准品至25 mL 容量瓶中，用适量甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，即得1 mg/mL 的标准品溶液。

1.2.5 标准曲线的绘制 取6 支10 mL 试管，分别加入“1.2.4”项下标准品溶液0、1、2、3、4、5 mL，精密加入4%香草醛-甲醇溶液3 mL、浓盐酸1.5 mL，摇匀，30 ℃水浴反应30 min，500 nm 波长处测定吸光度［12］。以原花青素浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制原花青素标准曲线图。

1.2.6 评价指标

原花青素提取率=提取液中原花青素浓度×提取液体积/葡萄果渣质量×（1-葡萄果渣水分含量）。

1.2.7 葡萄果渣中原花青素的提取

1）单因素试验。①低共熔溶剂类型。按照固定低共熔溶剂摩尔比（氯化胆碱∶氢键供体）1∶2、液固比30∶1、微波功率500 W、提取温度40 ℃、提取时间40 s 的参数进行提取试验［11-14］。以原花青素提取率为指标，确定低共熔溶剂种类。②低共熔溶剂摩尔比。在液固比30∶1、微波功率500 W、提取温度40 ℃、提取时间40 s 条件下，用氯化胆碱/丙三醇作提取剂，计算原花青素提取率，确定摩尔比。③微波功率。在液固比30∶1、提取温度40 ℃、提取时间40 s条件下，以摩尔比1∶3 的氯化胆碱/丙三醇作提取剂进行提取。计算原花青素提取率，确定微波功率。④液固比。在微波功率420 W、提取温度40 ℃、提取时间40 s 条件下，以摩尔比1∶3 的氯化胆碱/丙三醇作提取剂，考察不同的液固比对原花青素提取量的影响。计算原花青素提取率，确定液固比。⑤提取时间。原花青素提取率会随提取时间的延长而增加，但提取时间过长会导致原花青素降解，因此通过预试验结果确定微波提取时间为40 s。⑥提取温度。温度过高易导致原花青素发生降解，因此确定提取温度为40 ℃。

2）正交试验设计。在单因素试验结果基础上，设计正交试验，得到最佳工艺。

1.2.8 原花青素稳定性研究 以“1.2.7”项下试验最佳工艺葡萄果渣提取液为原料，以原花青素保留率为评价指标，分别连续间隔1 h 进行测定，考察在pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，温度为4、20、40、60、80 ℃，室内日光灯照下与室内避光，氧化剂（H2O2）浓度为0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，还原剂（维生素C）浓度为0、0.04、0.08、0.16、0.32 g/L，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等金属离子对原花青素保留率的影响［15，16］。

式中，A1为检测溶液原花青素吸光度；A2为初始样品溶液原花青素吸光度。

2 结果与分析

2.1 线性关系结果

由图1可知，标准曲线方程为A=1.049C+0.013 1，相关系数R2=0.999，原花青素浓度在0.10～0.50 mg/mL范围内呈线性关系。

图1 原花青素浓度-吸光度标准曲线

2.2 葡萄果渣中原花青素的提取工艺单因素试验结果

2.2.1 低共熔溶剂类型对原花青素提取率的影响由表1 可知，以氯化胆碱/丙三醇为溶剂组提取率最高，为18.86%，其次是氯化胆碱/丙二醇，为18.42%，氯化胆碱/草酸组为17.75%。即多元醇对原花青素的提取率较高，且随着醇羟基的增加提取率提高，有机酸组的提取率稍低，可能是由于醇羟基和有机酸对原花青素的氢键作用更强；糖供体的提取率最低，可能与糖的极性偏大有关。但可以看出多元醇和有机酸供体试验得到的提取率相差不大，因此，选择氯化胆碱/丙三醇、氯化胆碱/丙二醇、氯化胆碱/草酸作为提取溶剂，采用正交试验设计进一步研究。

表1 低共熔溶剂类型对原花青素提取率的影响结果

2.2.2 低共熔溶剂摩尔比对原花青素提取率的影响 由图2 可知，当摩尔比（氯化胆碱∶氢键供体）为1∶3 时，原花青素提取率最大，为19.19%；当摩尔比为1∶2 时，为18.73%；当摩尔比为1∶4 时，为18.67%。因此选择摩尔比为1∶2、1∶3、1∶4 作为摩尔比的考察因素水平。

图2 摩尔比对原花青素提取率的影响

2.2.3 微波功率对原花青素提取率的影响 由图3可知，当微波功率为420 W 时，提取率为19.26%；当微波功率为560 W 时，提取率为18.75%；当微波功率为280 W 时，提取率为18.58%。因此选择280、420、560 W 作为微波功率的考察水平。

图3 微波功率对原花青素提取率的影响

2.2.4 液固比对原花青素提取率的影响 由图4 可知，当液固比为40∶1 时，原花青素的提取率最大，为17.96%。因此选择30∶1、40∶1、50∶1 作为液固比的考察水平。

图4 液固比对原花青素提取率的影响

2.3 正交试验安排及结果

采用L9（34）正交试验，以原花青素的提取率为评价指标进行试验研究，正交试验因素水平与结果分析见表2、表3，方差分析见表4。

表2 葡萄果渣提取工艺因素与水平

表3 正交试验安排及结果

表4 正交试验结果方差分析

通过正交试验结果可以得出，葡萄果渣中原花青素的最佳提取工艺为A3B2C2D2，即在微波功率420 W、提取温度40 ℃、提取时间40 s、液固比40∶1的条件下，以摩尔比1∶2 的氯化胆碱/丙三醇作提取剂进行提取。通过直观分析可以看出因素的影响大小为C＞B＞A＞D，即微波功率影响最大，液固比影响最小。

2.4 验证试验

对最佳提取工艺进行验证试验，由表5 可知，该工艺稳定可行，平均提取率达19.57%。

表5 验证试验结果

2.5 原花青素的稳定性研究

2.5.1 pH 对原花青素保留率的影响 pH 对原花青素保留率的影响见表6。通过试验结果可以看出，当pH≤2 时，5 h 后原花青素的保留率仍在85%以上，当pH≥3 时，5 h 后原花青素的保留率均低于70%，随着pH 的增大，原花青素稳定性逐渐降低。

表6 pH 对原花青素保留率的影响

2.5.2 温度对原花青素保留率的影响 由图5 可知，2 h后60 ℃以及80 ℃的保留率均低于80%，而5 h后只有4 ℃条件下保留率在80%以上，室温20 ℃条件下接近80%，由此可见，温度升高，原花青素快速降解，造成原花青素的损失。因此原花青素需在20 ℃以下保存，最佳温度为4 ℃左右。

图5 温度对原花青素保留率的影响

2.5.3 光照对原花青素保留率的影响 由图6 可知，随着光照时间的延长，日光灯下原花青素的保留率急剧下降，5 h 后保留率仅有60%，而避光下保留率仍在80%以上。由此可见，较强的光照会使原花青素发生降解。

图6 光照对原花青素保留率的影响

2.5.4 氧化剂（H2O2）对原花青素保留率的影响 由图7 可知，反应2 h 后，H2O2溶液组保留率均发生比较明显下降，为90%以下，5 h 后下降到60%以下；H2O2溶液浓度越高，保留率下降趋势越明显。可能原因是H2O2使原花青素开环生成查尔酮，进一步发生化学反应生成酯类物质。

图7 H2O2对原花青素保留率的影响

2.5.5 还原剂（维生素C）对原花青素保留率的影响 由图8 可知，当维生素C 浓度低于0.32 g/L 时，原花青素3 h 的保留率仍为80%以上，5 h 时也没有大幅度的下降，当浓度达0.32 g/L 时，3 h 后原花青素的保留率急剧下降，由此可见，随着时间的延长和维生素C 浓度的升高，原花青素的保留率会逐渐降低，但维生素C 浓度低于0.32 g/L 时，原花青素的保留率相对稳定，说明维生素C 也在一定程度上保护原花青素。

图8 维生素C 对原花青素保留率的影响

2.5.6 金属离子对原花青素保留率的影响 由图9可知，加入金属离子后，随着时间的延长，原花青素的保留率逐渐降低，其中Zn2+存在条件下，原花青素保留率下降较缓慢，5 h 后保留率仍然在80%左右，在K+、Na+、Ca2+、Mg2+存在条件下，原花青素保留率下降较明显，4 h 后，保留率均在80%以下，说明这些金属离子对原花青素的稳定性有一定的破坏作用。

图9 金属离子对原花青素保留率的影响

3 讨论

1）本试验选择低共熔溶剂，与传统的提取技术相比，可以使得原花青素的提取率提升近20%。一方面，低共熔溶剂简单易得，造价低廉，稳定性高，绿色环保，在今后的生活生产中还有极大的开发潜能；另一方面，试验所提取的原花青素不仅能够运用于食品的添加，在药用价值上也有着不可估量的前景。

2）稳定性试验中，发现当pH 为4 时会发生比较剧烈的变化，原花青素的保留率2 h 时已经降到70%以下，其机制仍需进一步研究。在对金属离子的研究过程中，Zn2+对其保留率的影响比较缓和，这可能与Zn2+分子量稍大，带有金属活性等有关，金属离子对原花青素的影响有待更全面和深入研究。

3）目前原花青素利用的发展前景非常广阔，如通过制备甲基壳聚糖微纳米粒子等多种创新技术，大大提高了植物原花青素的稳定性。但是这些研究方法由于高技术成本、低质量安全性等原因尚未完全得到广泛推广应用，相关的化学作用机理也不清楚，原花青素的营养质量和生物稳定性也有待进一步研究。