分子改良提高甘露聚糖酶的耐热性

王亚伟 薛强 熊海容

摘要：以来源于嗜热放线菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶基因（KJ806638）为研究对象，利用易错PCR方法对其进行改造，获得了耐热性进一步提高的甘露聚糖酶。筛选获得的N16I突变株，其最适反应温度从72.5 ℃提升到77.5 ℃。差示扫描荧光定量（DSF）检测结果显示，酶蛋白质的表观解链温度Tm从61.9 ℃提升到 63.2 ℃。

关键词：甘露聚糖酶；易错PCR；热稳定性

中图分类号：Q55         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0151-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.027 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Improving the thermotolerance of mannanase through molecular improvement

WANG Ya-wei1，XUE Qiang2，XIONG Hai-rong2

（1.School of Life Science and Technology，Wuhan Polytechnic University，Wuhan  430048，China；

2. College of Life Sciences， South-Central Minzu University， Wuhan  430074，China）

Abstract：The mannanase gene （KJ806638） from Thermobifida fusca was used as the research object， and it was modified by the error-prone PCR method， and the heat resistance of mannanase was further improved. The optimum reaction temperature of N16I mutant was increased from 72.5 ℃ to 77.5 ℃. Differential scanning fluorometry （DSF） testing results showed that the apparent decomposition temperature Tm of the enzyme protein increased from 61.9 ℃ to 63.2 ℃.

Key words： mannanase； error-prone PCR； thermostabilty

甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类［1］，现已被广泛应用于饲料、造纸、洗涤剂、食品和石油开采及生物质能源等领域，尤其在功能性低聚糖制备和添加剂等方面应用前景十分广阔。在饲料行业，甘露聚糖是饲料中主要抗营养因子之一，会增加食糜在畜禽消化道内的黏度，导致畜禽对饲料中营养物质的消化吸收受到影响，致使饲料的消化利用率降低［2］。在石油方面，甘露聚糖酶常被用作压裂液的破胶剂，可以增强压裂液的导流能力，减少破坏性物质的残留，从而提高产油量［3］。在造纸过程中，甘露聚糖酶可用作处理纸浆的漂白剂，可以有效促进木质素的降解而保留纤维素［4］。

工业生产过程中，往往存在高温等极端环境，高温环境能加快酶促反应速度，提高液体物料的流动性能，防止有害微生物在过程中的生长繁殖等［5，6］。普通中温甘露聚糖酶在高温下会发生结构变化，从而大幅度地丧失活性。来源于嗜热放线菌（Thermobifida fusca）的耐热甘露聚糖酶［7］进行水解，能从根本上解决高温环境使加入的酶很快失活的问题。

易错PCR技术［8］是在正常PCR技术上演变而来的，它是一种使DNA在复制扩增过程中更容易出现错误配对的PCR技术，因此又称为错配PCR或倾向错误PCR。易错PCR通常是利用低保真度的Taq DNA聚合酶和改变一些PCR反应体系等手段，来降低PCR过程中DNA复制的保真度，使错配率升高，从而得到与原来不同的DNA序列或基因。将该酶基因序列通过易错PCR突变后，通过表达和酶特性鉴定后筛选，获得的更高耐热性的甘露聚糖酶突变体4号，在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、酿造、纺织和医药等领域具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 菌株质粒和试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、质粒pET-22b（+）均为实验室保藏，质粒pAOhr-ManB来源于武汉擎科生物科技有限公司合成。限制性内切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等工具酶购自TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。IPTG、X-Gal、SDS及角豆胶购自Sigma公司，TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为国药试剂。

50 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：取7.10 g磷酸氢二钠溶解于800 mL去离子水中，用柠檬酸调节pH为4.0～7.5范围内任一值后，定容至1 L。50 mmol/L Tris-HCl缓冲液：取6.06 g Tris溶解于800 mL去离子水中，用1 mol/L HCl調节pH至7.5～9.0，定容至1 L。50 mmol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：取7.50 g甘氨酸溶解于800 mL去离子水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0～11.0，定容至1 L。

1.2 易错PCR突变和表达

将实验室保藏的菌株Escherichia coli DH5α-pAOhr-ManB扩大化培养，使用试剂盒提取质粒pAOhr-ManB作为模板，扩增甘露聚糖酶的基因，以回收的片段为模板，进行易错PCR。所用的引物序列见表1。

易錯PCR通过改变体系中锰离子浓度和4种脱氧核糖核苷酸的浓度比例，使甘露聚糖酶的碱基序列发生随机突变，从而得到多个甘露聚糖酶ManB的突变基因序列。易错PCR的操作体系见表2。基因扩增、大肠杆菌表达和蛋白质提纯方法见参考文献［9，10］。

1.3 酶学性质检测

原酶及突变酶最适温度测定［11］：采用3，5-二硝基水杨酸方法（简称DNS法）对原酶及突变酶的最适温度进行测定，以0.5%角豆胶为底物，在pH 7.0反应条件下，分别测定不同温度梯度（50～85 ℃）下的酶活力，酶活力最高点为最适反应温度，以测得的最大酶活值为100%，计算不同温度下的相对酶活力，每个反应设置3个平行。

差示扫描荧光定量（Differential scanning fluorometry， DSF）测定［12］：检测不同重组酶蛋白的表观解链温度即Tm。DSF试验只需要少量纯化的蛋白质（10～25 μL），其最低蛋白质浓度为0.1～0.3 mg/mL，将蛋白质和荧光染料均匀混合加入96孔板中，再放入实时荧光定量PCR仪中，可以在较短时间内完成测量过程，这些特点使DSF方法可以快速测量蛋白质的热稳定性。将20 μL纯化后的不同酶蛋白质与5 μL的100×SYPRO Orange染料混合离心，设置实时荧光定量PCR系统中以0.1 ℃的增幅从30 ℃到99 ℃加热样品，并同时测得其荧光值，根据荧光值的变化来测定重组酶的Tm。

2 结果与分析

2.1 甘露聚糖酶突变株基因的获得和表达

本实验室保藏的甘露聚糖酶（PDB：1BQC）基因来源于Thermobifida fusca，在不改变氨基酸序列的情况下，对该酶基因序列进行序列重排与密码子优化。为了便于对该基因进行分子操作，消除了基因序列中的限制性内切酶位点，合成了一个新基因ManB（KJ806638）。同时在甘露聚糖酶ManB基因的两端分别设计添加酶切位点Nco I和Xho I，交由武汉擎科生物科技有限公司完成全基因合成，获得重组载体pAOhr-ManB。以pAOhr-ManB质粒作为模板，设计引物，通过使用Taq酶和改变PCR体系中的Mn2+浓度和4种脱氧核糖核苷酸的浓度比例，使甘露聚糖酶的碱基序列发生随机突变，从而得到多个甘露聚糖酶ManB的突变基因序列。本研究筛选获得的突变酶氨基酸序列信息如下（突变位点为N16I）：

MATGLHVKNGRLYEAIGQEFIIRGVSHPHNWYPQHTQAFADIKSHGANTVRVVLSNGVRWSKNGPSDVANVISLCKQNRLICMLEVHDTTGYGEQSGASTLDQAVDYWIELKSVLQGEEDYVLINIGNEPYGNDSATVAAWATDTSAAIQRLRAAGFEHTLVVDAPNWGQDWTNTMRNNADQVYASDPTGNTVFSIHMYGVYSQASTITSYLEHFVNAGLPLIIGEFGHDHSDGNPDEDTIMAEAERLKLGYIGWSWSGNGGGVEYLDMVYNFDGDNLSPWGERIFYGPNGIASTAKEAVIFGLEHHHH

HH

采用限制性内切酶EcoR I和Not I完成甘露聚糖酶突变株N16I的基因和分泌型表达载体pET-22b（+）双酶切，再使用T4连接酶将两者连接，构建重组表达质粒。将该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株，并测序验证。验证正确后发酵产酶，纯化得到酶蛋白。目标甘露聚糖酶ManB的三维结构如图1所示。

2.2 甘露聚糖酶的性质分析

2.2.1 甘露聚糖酶最适温度的测定 由图2可知，以0.5%角豆胶为底物，在pH 7.0和反应时间10 min的条件下，原甘露聚糖酶ManB的最适反应温度在72.5 ℃左右，而同样条件下突变体酶的最适反应温度为77.5 ℃，显示出突变酶的最适反应温度明显提高。

2.2.2 甘露聚糖酶的热稳定性分析 由图3可知，甘露聚糖酶ManB和其突变体均具有较好的耐热性，在65 ℃处理30 min后仍无灭活现象。突变酶在70 ℃条件下处理后的残余酶活力高于原酶，显示出突变酶的耐热性能明显提高。

2.2.3 甘露聚糖酶Tm的测定 根据荧光值的变化来测定原酶和突变酶的Tm如图4所示。由图4可知，酶蛋白质的表观解链温度Tm从原酶的61.9 ℃提升到突变酶的 63.2 ℃。测定结果进一步证实了突变酶的耐热性提高。

3 小结

本研究将Thermobifida fusca来源的β-甘露聚糖酶ManB在大肠杆菌BL21中进行了异源表达，并通过易错PCR技术对该酶的基因序列进行了两轮易错PCR，得到突变体文库。通过筛选获得了一株性能较好的突变甘露聚糖酶N16I，并对其酶学性质进行了分析，其耐热性得到了提升［13-15］。本研究为甘露聚糖酶的分子改造和生产提供了一定的依据和基础。

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