酸性染料比色法测定对叶百部中总生物碱含量

吴港圆 覃海琴 胡东南 张淼 谢凤凤 王孝勋

摘要：采用酸性染料比色法测定不同发育时期的对叶百部（Stemona tuberosa Lour.）中总生物碱含量，采用酸性染料比色法，以对叶百部碱为对照品，溴麝香草酚蓝为酸性染料，甲醇、三氯甲烷提取，4%盐酸溶解，在413 nm 波长下测定。结果表明，对叶百部碱的标准曲线为Y=0.003 7X+0.089 （R2=0.995 9），在32～800 μg/mL范围内线性关系良好；平均加样回收率为101.23%，平均加样回收率的RSD为2.63%。1年生对叶百部总生物碱含量为1.87～4.55 mg/g；2年生对叶百部总生物碱含量为4.52～9.63 mg/g。酸性染料比色法具有操作简便、重复性好、稳定性高的优点。

关键词：对叶百部（Stemona tuberosa Lour.）；总生物碱；酸性染料比色法；不同发育时期

中图分类号：R917         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0154-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.028 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of total alkaloid in Stemona tuberosa Lour. by acid dye colorimetric method

WU Gang-yuan1a，QIN Hai-qin1a，HU Dong-nan2，ZHANG Miao1b，XIE Feng-feng1b，WANG Xiao-xun1a

（1a.College of Pharmacy， 1b.Key Laboratory of Zhuang Yao Medicine in Guangxi，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning  530200， China；2. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning  530023， China）

Abstract： The total alkaloid content in Stemona tuberosa Lour. at different developmental stages was determined using the acid dye colorimetric method. The acid dye colorimetric method was used， with Stemona tuberosa Lour. alkali as the reference material and bromothymol blue as the acid dye. Methanol and chloroform were extracted， and dissolved in 4% hydrochloric acid. The determination was carried out at a wavelength of 413 nm. The results showed that the standard curve of Stemona tuberosa Lour. alkali was Y=0.003 7X+0.089 （R2=0.995 9）. The linear relationship was good  from 32 to 800 μg/mL；the average sample recovery rate was 101.23%， and the RSD of the average sample recovery rate was 2.63%. The total alkaloid content of annual Stemona tuberosa Lour. was 1.87～4.55 mg/g；the total alkaloid content of the biennial Stemona tuberosa Lour. was 4.52～9.63 mg/g. The acid dye colorimetric method had the advantages of simple operation， good repeatability， and high stability.

Key words： Stemona tuberosa Lour.； total alkaloid； acid dye colorimetric method； different developmental stages

中藥百部为百部科百部属植物直立百部（Stemona sessilifolia Miq.）、蔓生百部（Stemona japonica （Bl.） Miq.） 或对叶百部（Stemona tuberosa Lour.）的干燥块根，甘、苦，微温，归肺经，具有润肺下气止咳、杀虫灭虱的功效［1］，对叶百部是目前市场上百部类药材的主要来源［2］。对叶百部包含生物碱类和其他非生物碱类化学成分。生物碱类是百部属植物的主要化学成分及活性成分［3］，是百部止咳和杀虫的主要活性物质［4，5］。百部药材中的生物碱成分在类别和含量上有差异，直立百部和蔓生百部的化学成分基本相同，而对叶百部与直立百部、蔓生百部的化学成分差异显著［6-8］。中药材的质量评价以2020年《中华人民共和国药典（一部）》（以下简称《中国药典》）为准则，保证中药安全、有效、稳定及可控。《中国药典》中以生物碱为主要活性成分的多味中药材均以生物碱成分为评价指标，如苦参的含量测定以苦参碱和氧化苦参碱为评价指标，麻黄的含量测定以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为评价指标，防己的含量测定以粉防己碱和防己诺林碱为评价指标。但《中国药典》中尚未收载百部药材的含量测定方法，百部项下仅有性状、鉴别、浸出物、生物碱的理化鉴别方法等项目，其质量标准中既没有TLC定性鉴别，也没有含量测定，不能有效评价、控制百部药材和相关制剂的质量。本研究建立对叶百部中总生物碱含量的酸性染料比色测定方法，为百部（对叶百部）质量标准体系的完善提供技术参考。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

对叶百部样品为2019年10月下旬至2020年1月上旬在广西防城港市、梧州市、贺州市、桂林市、河池市、崇左市、百色市等地区采集的野生植株，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为对叶百部。采用幼苗迁地栽培的方式种植于广西中医药大学仙葫药圃，并根据时节与实际需求进行浇水、除草、松土、引藤上架及施肥等田间管理。1年生的样品于2021年春季采挖，按照《中国药典》的方法进行净制、蒸煮、切片、烘干、打粉，过50目筛备用。2年生的样品于2022年采挖，处理方式同1年生的样品。

1.2 试剂和仪器

对叶百部碱（含量≥98%）购自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷等试剂均为分析纯。UV-2600型紫外可见分光光度计购自岛津仪器（苏州）有限公司；低温旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司；SQP型电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；BSA224S型电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PHSJ-4A型实验室pH计购自上海仪电科学仪器股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 对叶百部总生物碱的理化鉴定

参照《中国药典》百部项下的理化鉴定方法，取对叶百部粉末3 g，加70%乙醇50 mL，超声波提取40 min，滤过，滤液蒸去乙醇，残渣加氨水调节pH至10～11，加入三氯甲烷4 mL，振摇提取3次，分取三氯甲烷层，低温旋蒸，蒸干，残渣加1%盐酸溶液5 mL，溶解，滤过。滤液分为2份：一份滴加碘化铋钾试液；另一份滴加硅钨酸试液。1年生的11个样品及2年生的10个样品均表现为碘化铋钾显色反应有橙红色沉淀生成，硅钨酸显色反应有乳白色沉淀生成。

2.2 溶液制备

精密称取对叶百部碱10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，即得0.2 mg/mL对叶百部碱对照品溶液。称取溴甲酚绿粉末0.1 g，加2.8 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液，再加去离子水稀释至200 mL，超声波提取15 min，即得溴甲酚绿溶液。称取溴麝香草酚蓝粉末0.1 g，加3.2 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液，再加去离子水稀释至 200 mL，超声波提取15 min，即得溴麝香草酚蓝溶液。精密称取对叶百部粉末（过50目筛）1.000 0 g，加40 mL甲醇，超声波提取20 min。放置室温，滤过，得到醇提液。挥干甲醇，用4%盐酸溶解，抽滤。滤液用氨水调节pH至9～10，沉淀和滤液均转移至分液漏斗中，20 mL三氯甲烷萃取，分取三氯甲烷层，低温旋蒸，蒸干三氯甲烷。甲醇溶解，定容：1年生的样品定容至25 mL；2年生的样品定容至50 mL，即得供试品溶液。

2.3 测定波长和酸性染料的种类及用量选择

取1 mL供试品溶液2份，分别置于60 mL分液漏斗中，一份中加入7 mL pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲液、3 mL溴甲酚绿溶液，4 mL三氯甲烷萃取，振摇  5 min，静置30 min，分取三氯甲烷层，重复萃取3次，定容至10 mL，全波长扫描；另一份加入7 mL pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲液、3 mL溴麝香草酚蓝溶液，4 mL三氯甲烷萃取，振摇5 min，静置30 min，分取三氯甲烷层，重复萃取3次，定容至10 mL，全波长扫描。同法取1 mL对照品溶液2份，分别加溴甲酚绿溶液、溴麝香草酚蓝溶液进行全波长扫描。同法取1 mL三氯甲烷制备空白对照。由图1可知，供试品溶液、对照品溶液在采用溴甲酚绿溶液、溴麝香草酚蓝溶液作为酸性染料时，均在413 nm波长处吸光度（A）最大，且A溴麝香草酚蓝>A溴甲酚绿，故确定测定波长为413 nm，酸性染料为溴麝香草酚蓝，溴麝香草酚蓝酸性染料用量分别为3、4、5、6 mL。考察溴麝香草酚蓝酸性染料用量对紫外吸收的影响，结果表明，A5 mL>A6 mL>A4 mL>A3 mL，故确定酸性染料溴麝香草酚蓝的用量为5 mL。

2.4 缓冲液类型、pH及用量的选择

以5 mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，分別考察了邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液对供试品溶液及对照品溶液的紫外吸收影响，结果表明，A乙酸-乙酸钠缓冲液>A邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液，故确定缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。以乙酸-乙酸钠为缓冲液，5 mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，乙酸-乙酸钠缓冲液pH分别为4.2、4.6、5.0、5.4。考察乙酸-乙酸钠缓冲液pH对紫外吸收的影响，结果表明ApH 5.0＞ApH 5.4＞ApH 4.2＞ApH 4.6，故确定乙酸-乙酸钠缓冲液pH为5.0。考察缓冲液用量分别为5、6、7、8、9 mL时对紫外吸收的影响，结果表明，A8 mL>A7 mL>A6 mL>A9 mL>A5 mL，故确定乙酸-乙酸钠缓冲液的用量为8 mL。

2.5 试剂加入顺序的选择

以8 mL pH 5.0乙酸-乙酸钠为缓冲液，5 mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，试剂加入顺序分别为供试品-缓冲液-酸性染料-三氯甲烷、供试品-酸性染料-缓冲液-三氯甲烷、缓冲液-供试品-酸性染料-三氯甲烷、缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷、酸性染料-缓冲液-供试品-三氯甲烷和酸性染料-供试品-缓冲液-三氯甲烷。考察试剂加入顺序对紫外吸收的影响，结果表明，A缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷>A酸性染料-缓冲液-供试品-三氯甲烷> A酸性染料-供试品-缓冲液-三氯甲烷>A缓冲液-供试品-酸性染料-三氯甲烷> A供试品-酸性染料-缓冲液-三氯甲烷>A供试品-缓冲液-酸性染料-三氯甲烷，故确定试剂加入顺序为缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷。

2.6 三氯甲烷萃取次数的选择

分別考察三氯甲烷（每次4 mL）萃取1、2、3、4次后是否还有紫外吸收，结果表明萃取1次及2次后的溶液紫外吸收明显且A1次>A2次，萃取3次及4次后的溶液基本无紫外吸收且二者紫外吸收无明显差别，故确定三氯甲烷萃取次数为4次，定容至15 mL。

2.7 测定方法的确定

取60 mL分液漏斗，依次加入8 mL pH 5.0 乙酸-乙酸钠缓冲液、5 mL溴麝香草酚蓝酸性染料、   1 mL待测溶液和4 mL三氯甲烷，振摇5 min，静置30 min，分取三氯甲烷层，三氯甲烷萃取4次，定容至15 mL，混匀。413 nm波长下测定吸光度。取1 mL三氯甲烷进行同法操作，制备空白对照。

2.8 线性关系的考察

分别配制32、80、160、320、400、800 μg/mL的对叶百部碱对照品溶液，按照“2.7”方法在413 nm波长处测定吸光度。以对叶百部碱对照品溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=0.003 7X+0.089（R2=0.995 9），在线性范围为32～800 μg/mL时对叶百部碱对照品溶液浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.9 精密度、重复性、稳定性及加样回收率的考察

精密量取1mL对叶百部碱对照品溶液，按照“2.7”方法重复测定6次，吸光度的相对标准偏差（RSD）为0.21% ，表明仪器的精密度良好。分别精密称取6份对叶百部粉末样品，每份1.000 0g，按照“2.2”方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.7”方法操作，同时制备相应空白，测定吸光度，样品中总生物碱的平均含量为2.29 mg/g，RSD为1.94%，表明该方法的重复性良好。精密称取1份对叶百部粉末样品1.000 0 g，按照“2.2”方法制备供试品溶液，按照“2.7”方法每隔1 h测定其吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为2.31%，表明溶液在5 h 内稳定性良好。取6份已知含量的对叶百部样品溶液25 mL，加入对叶百部碱对照品溶液，配成50 mL加标溶液。按照“2.7”方法操作，同时制备相应空白溶液，测定吸光度，平均加样回收率为101.23%，平均加样回收率的RSD为2.63%，表明该方法的回收率良好。

3 对叶百部样品总生物碱含量的测定

分别取1年生和2年生的对叶百部11批和10批样品粉末，各平行制备3份，每份1.000 0 g，精密量取。按照“2.2”方法制备供试品溶液，按照“2.7”方法操作，在413 nm波长处分别测定吸光度，测定不同发育时期对叶百部样品的吸光度，取平均值，带入标准曲线计算总生物碱含量，如表1所示。1年生对叶百部总生物碱含量为1.87～4.55 mg/g；2年生对叶百部总生物碱含量为4.52～9.63 mg/g。

4 小结与讨论

百部药材及其浸膏总生物碱含量常见的测定方法有酸性染料比色法［9-11］、响应面分析法［12］等，其中酸性染料比色法在其他中药材总生物碱含量测定上也有应用，具有操作简便、重复性好、稳定性高的优点［13-15］。对叶百部中生物碱成分丰富，主要包括对叶百部碱、新对叶百部碱、金刚大碱、百部新碱等［16］，广西对叶百部的主要生物碱成分为百部新碱，其次为对叶百部碱和金刚大碱，新对叶百部碱较少见［17］。对叶百部生物碱成分有差异，选择单一成分作为含量测定标准存在一定误差，生物碱作为对叶百部的主要活性成分，以总生物碱成分作为含量测定的标准具有一定的合理性及可行性。

采用酸性染料比色法测定不同发育时期对叶百部的总生物碱含量，考察已报导的酸性染料比色法后，优化了测定条件。本研究对常用酸性染料溴麝香草酚蓝和溴甲酚绿进行比较分析，发现对叶百部待测样品及其对照品经酸性染料溴麝香草酚蓝染色后得到的有色溶液在413 nm处吸光度最大，故选择溴麝香草酚蓝为酸性染料，413 nm为测定波长。为了避免酸性染料因未完全溶解而影响试验结果，需对酸性染料进行15 min的超声波处理。此外，酸性染料比色法的影响因素还有缓冲液的种类、缓冲液的pH及用量、酸性染料用量、试剂加入顺序以及三氯甲烷萃取次数等。三氯甲烷萃取第3次时已基本无紫外吸收，但定容时为了避免测定结果因萃取不完全而导致误差，应多萃取1次并以此次进行定容，故选择三氯甲烷萃取4次，定容至15 mL。方法考察及测定时空白对照溶液的制备需按照待测液进行同法操作。本研究进行了精密度、重复性、稳定性及加样回收率的考察，结果表明，酸性染料比色法精密度较好，系统误差在允许范围之内，测试结果准确度较高，可靠性较强。

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