HPLC-ELSD法测定梅子提取物中糖和糖醇的含量

马舒翼 梁佳欣 许春平 张婷 李冉 董爱君 肜霖

摘要：建立了一種高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）同时测定梅子提取物中果糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖水合物、麦芽三糖、麦芽四糖的方法。分离采用Grace Prevail Carbohydrate ES色谱柱，柱温为30 ℃；流动相为乙腈-水，流速为1.00 mL/min；检测使用蒸发光散射检测器，漂移管温度为60 ℃，氮气流速为2.50 L/min。结果表明，果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖水合物、麦芽三糖、麦芽四糖分别在34.69～2 220.00、16.22～1 038.00、38.66～2 474.00、24.53～1 570.00、22.91～1 466.00、6.09～390.00、14.69～940.00 μg/mL范围内线性关系良好，精密度良好，重复性的相对标准偏差（RSD）为1.00%～4.09%，各目标物的回收率为85.5%～110.1%，精密度为0.3%～4.6%（n=6）。本方法在30 min内实现了糖和糖醇的分离，灵敏度和重复性检测较好，有效避免了溶剂及温度的影响，测量结果较准确且操作方便，可用于批量检测梅子提取物中糖和糖醇的含量。

关键词：高效液相色谱（HPLC）；蒸发光散射检测器（ELSD）；梅子提取物；糖；糖醇

中图分类号：TS411         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0158-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.029 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of sugar and sugar alcohol content in plum extract by HPLC-ELSD

MA Shu-yi1， LIANG Jia-xin1， XU Chun-ping1， ZHANG Ting3， LI Ran 2， DONG Ai-jun2， RONG Lin2

（1.College of Tobacco Science and Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou  450000，China； 2. China Tobacco Hubei Industrial Co.， Ltd.， Wuhan  430040，China； 3. School of Pharmacentical Sciences， South-Central University Minzu， Wuhan  430074，China）

Abstract： A high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） method was established for the simultaneous determination of fructose， glucose， sorbitol， sucrose， maltose hydrate， maltotriose， and maltotriose in plum extract. The separation was carried out using a Grace Prevail Carbohydrate ES column at a column temperature of 30 ℃； the mobile phase was acetonitrile water， with a flow rate of 1.00 mL/min；the detection used an evaporative light scattering detector， with a drift tube temperature of 60 ℃ and a nitrogen flow rate of 2.50 L/min. The results showed that fructose， sorbitol， glucose， sucrose， maltose hydrate， maltotriose， and maltotetraose had a good linear relationship，ranging from 34.69～2 220.00， 16.22～1 038.00， 38.66～2 474.00， 24.53～1 570.00， 22.91～1 466.00， 6.09～390.00 and 14.69～940.00 μg/mL，respectively，the precision was good， and the relative standard deviation （RSD） of repeatability was 1.00%～4.09%， the recovery rates of each target substance were 85.5%～110.1%， and the precision was 0.3%～4.6% （n=6）. This method achieved the separation of sugar and sugar alcohols within 30 minutes， with good sensitivity and repeatability detection， effectively avoiding the influence of solvents and temperature. The measurement results were accurate and the operation was easy， which could be used for batch detection of sugar and sugar alcohols in plum extract.

Key words： high performance liquid chromatography （HPLC）； evaporative light scattering detector （ELSD）； plum extract； sugar； sugar alcohol

梅子，别称垂枝梅、乌梅、酸梅等，是蔷薇科杏属植物梅（Armeniaca mume Sieb.）的果实，距今有3 000多年的栽培历史，品种多样，在中国各地均有栽培，但以长江流域以南各省最多［1］。梅是一种经典的药食同源植物，营养物质丰富，有止咳、止泻、生津、止渴之效［2］；其鲜花可提取香精，叶、根、种仁、果实均可入药，果实及其提取物也是食品工业常用的天然原料，可通过干制、盐渍、熏制等加工成蜜饯、果脯、果汁、果酒等食品［3-5］。

梅子中的有机酸和糖类物质是产生食品风味的主要物质基础［6，7］，也是在食品工业上应用的关键成分，其含量也是確定梅子产品质量是否合格的重要指标之一，因此对梅子提取物中有机物和糖类物质的快速、准确检测是提高食品质量的关键。目前对梅子有机酸成分检测方法及优化的研究较多［8-10］，但针对梅子提取物糖类物质的检测方法研究较少。

目前，关于糖类物质含量的测定主要采用容量法［11］、分光光度法［12］、酶分析法［13］、旋光法、色谱分析法等［14-16］。总的来说，色谱分析法的准确度及精密度均较高；气相色谱［17，18］、液相色谱［19-22］结合不同的检测器，可对各种糖类物质进行分离和定量，其中，液相色谱检测器常采用示差折光检测器（Refractive index detector，RID）和蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering detector，ELSD），而ELSD检测器是浓度型检测器，最大优势是响应值与溶质颗粒的大小和数量有关，与溶质的化学组成无关，即可检测不含发色团的化合物，响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，低温下也能使用，受溶剂和温度的影响小，灵敏度高，且适用于梯度洗脱，可弥补紫外检测器和RID的不足［23，24］，已被广泛应用于糖类物质的检测。本研究采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD），充分利用色谱法和ELSD检测器的优势，建立同时测定梅子提取物中7种糖和糖醇含量的方法，为梅子提取物中糖类成分的快速分析提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

14批次梅子品种、产地的具体信息见表1。

果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖水合物、麦芽三糖、麦芽四糖（纯度>99%，美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）。

2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ELSD 2424型蒸发光散射检测器（美国Waters公司）；SB-520DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5418R型离心机（艾本德有限公司）；Avanti J-E型离心机（美国贝克曼库尔特公司）；XS-205DU型电子分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；回流提取装置（武汉科析化玻仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 样品处理与分析

1.2.1 梅子提取物制备 将梅子（MZ-1至MZ-14）低温烘干，用粉碎机粉碎后各取100 g粉末样品，加500 mL去离子水浸泡30 min，加热回流提取2 h，过滤，将过滤得到的沉淀物按上述步骤进行二次加热回流提取、过滤，合并提取液后进行减压浓缩，减压浓缩至相对密度（20 ℃）为1.200 0±0.008 0，待浓缩液冷却至室温后，加入3倍体积的95%乙醇，搅拌均匀，沉降24 h，过滤，最后浓缩至相对密度（20 ℃）为1.300 0±0.008 0，经1.2×105 Pa高压灭菌20 min后存放于4 ℃冰箱备用［25，26］。

1.2.2 标准溶液与样品溶液制备 标准溶液制备：将250 mL 乙腈与250 mL去离子水超声波混合，用作稀释液。称取果糖（Fructose）11.10 mg、山梨醇（Sorbitol）5.19 mg、葡萄糖（Glucose）12.37 mg、蔗糖（Sucrose）7.85 mg、麦芽糖水合物（Maltose monohydrate）7.33 mg、麦芽三糖（Maltotriose）1.95 mg、麦芽四糖（Maltotetraose）4.70 mg于5 mL容量瓶中，用稀释液溶解定容，然后分别用2倍稀释法稀释成7个梯度（L1至L7）。

样品溶液的制备：称取梅子提取物，分别为MZ-1（119.57 mg）、MZ-2（121.67 mg）、MZ-3（101.04 mg）、MZ-4（169.93 mg）、MZ-5（117.67 mg）、MZ-6（136.07 mg）、MZ-7（161.94 mg）、MZ-8（186.16 mg）、MZ-9（225.23 mg）、MZ-10（210.25 mg）、MZ-11（222.34 mg）、MZ-12（210.26 mg）、MZ-13（257.20 mg）、MZ-14（219.27 mg），置于25 mL的容量瓶中，用稀释液溶解，并定容，配制成的样品溶液浓度分别为4.783、4.867、4.042、6.797、4.707、5.443、6.478、7.446、9.009、8.410、8.894、8.410、10.288、8.771 mg/mL，用0.45 μm针式滤膜过滤，滤液收集至进样瓶中待测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

色谱条件参照文献［27］的方法并稍作修改。色谱柱为Grace Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相A为水，流动相B为乙腈；洗脱梯度：0～25 min，85%～65% B；25～35 min，65%～55% B；35～45 min，55% B；45～55 min，55%～85% B。流速：1.00 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。漂移管温度：60 ℃；载气流速：2.50 L/min；进样量：10 μL。分离效果如图1所示。目标化合物在30 min内全部出峰。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围 将“1.2.2”方法配制的7种糖和糖醇各浓度梯度（L1至L7）的标准溶液进行HPLC-ELSD分析，由于ELSD的浓度与响应值为双对数关系［28］，因此以峰面积的对数Y为纵坐标，以标准溶液浓度（g/100 mL）的对数X为横坐标，绘制7种糖和糖醇的标准工作曲线，得到线性范围。结果（表2）表明，7种糖和糖醇在其线性范围内与峰面积呈线性关系，相关系数（R2）均≥0.998 0。

2.2.2 重复性试验 按“1.2.2”方法配制MZ-1梅子提取物样品溶液，在相同条件下进行6次平行测定，进样量10 μL，以峰面积计算相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）。结果（表3）表明，MZ-1梅子提取物中含有7种糖和糖醇，并且其相对标准偏差为1.00%～4.09%，说明该方法的重复性良好。

2.2.3 精密度和回收率 按“1.2.2”方法制備MZ-1梅子提取物样品溶液，加入高、中、低3个浓度的标准品混合母液，按照试验方法进行回收率试验并计算测定值的相对标准偏差，进样量10 μL，共做6组平行测定。结果（表4）表明，各目标物的回收率为85.5%～110.1%，精密度为0.3%～4.6%（n=6），说明该方法回收率较高，精密度良好，测定结果比较准确，适用于目标物的分析。

2.2.4 稳定性试验 按“1.2.2”方法制备MZ-1梅子提取物样品溶液，室温下放置0、2、4、8、12、24 h后分别进样（10 μL），计算目标物在不同放置时间后的相对标准偏差。其相对标准偏差为1.5%～4.5%，说明该方法在24 h之内稳定性良好（表5）。

2.3 梅子提取物的糖和糖醇含量分析

将梅子（MZ-1至MZ-14）提取物溶液各进样3次，14批梅子提取物的色谱如图2所示。14批梅子根据峰面积计算梅子提取物中糖和糖醇的含量，结果如表6所示。

新疆维吾尔自治区酸梅的糖和糖醇种类、含量相比乌梅和青梅均较少，糖和糖醇的种类仅有果糖、山梨醇和麦芽糖水合物。四川省、福建省省内不同批次乌梅的糖和糖醇含量差别均较小。而浙江省不同批次青梅的糖和糖醇含量差异较大；其他地区的青梅各有差异，安徽省、江西省、湖北省青梅的糖和糖醇种类和含量均较少；云南省、广东省青梅的糖和糖醇含量较高且含量差异较大。可反映出梅子甜味成分的含量，对梅子及梅子提取物在食品中的应用提供指导作用。

3 小结

本试验选取3个不同品种、9个不同产地的梅子共14批，采用加热回流提取法制备了梅子的水提物，经过抽滤、定容，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，用Grace Prevail Carbohydrate ES色谱柱分离，蒸发光散射检测器进行检测，建立一种可同时检测梅子提取物中7种糖和糖醇含量的方法，该方法的重复性相对标准偏差为1.00%～4.09%（n=6），各目标物的回收率为85.5%～110.1%，精密度为0.3%～4.6%（n=6）。该方法准确简单、易操作、灵敏度高、线性范围宽，适用于梅子提取物中糖和糖醇含量的常规检测。梅子提取物作为一种天然的食品添加剂，其糖类物质含量是反映味觉特征的重要指标，但因梅子产地、品种多，不同地质、气候条件、品种的梅子中糖类含量也不同，本研究也为梅子原料的产地筛选提供了技术手段。

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