广西不同产地红穿破石地上及地下部分HPLC指纹图谱研究

时间：2024-05-23

刘纤纤李文莉梁晓莲周楚惠陈勇罗孔现刘兆祥

摘要：為了建立红穿破石地上、地下部分HPLC指纹图谱，对10个产地红穿破石地上、地下部分的质量进行综合评价。采用Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL，通过相似度评价、结合聚类分析和主成分分析对10个产地红穿破石地上、地下部分进行评价。建立了红穿破石地上、地下部分HPLC指纹图谱，共标定13个共有峰。根据主成分综合得分模型，对10个产地红穿破石地上部分与地下部分进行综合评价，广西桂林市平乐县的红穿破石综合质量更优。该方法操作简便、重复性好、分析速度快，可用于红穿破石综合质量评价和规范红穿破石的质量。

关键词：红穿破石；HPLC指纹图谱；地上部分；地下部分；聚类分析；主成分分析；广西

中图分类号：R284 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0163-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.030 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on HPLC fingerprints of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from different producing areas in Guangxi

LIU Qian-qian1，2， LI Wen-li1， LIANG Xiao-lian1， ZHOU Chu-hui1， CHEN Yong1， LUO Kong-xian1， LIU Zhao-xiang1

（1. Science Experimental Center，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China；2. Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， Guangdong， China）

Abstract： In order to establish HPLC fingerprints of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa， a comprehensive evaluation was conducted on the quality of the aboveground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas. Using Agilent ZORBX SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） Chromatographic column， acetonitrile 0.1% phosphoric acid gradient elution was conducted， with the flow rate of 0.8 mL/min， column temperature of 25 ℃， detection wavelength of 254 nm， and injection volume of 10 μL. The above-ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas were evaluated through similarity evaluation， combined with cluster analysis and principal component analysis. This study had established HPLC fingerprints of the above-ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa and calibrated a total of 13 common peaks. According to the principal component comprehensive score model， a comprehensive evaluation was conducted on the above ground and underground parts of Radix Ventilago Leicocarpa from 10 production areas. The comprehensive quality of Radix Ventilago Leicocarpa in Pingle County， Guilin City， Guangxi was better. This method was easy to operate， had good repeatability， and fast analysis speed， and could be used for the comprehensive quality evaluation of Radix Ventilago Leicocarpa and to standardize the quality of Radix Ventilago Leicocarpa.

Key words： Radix Ventilago Leicocarpa； HPLC fingerprints； aboveground parts； underground parts； cluster analysis； principal component analysis； Guangxi

红穿破石原植株分布于广西、广东省、云南省、福建省等地区，又名血风藤（Ventilago leiocarpa Benth.）［1-3］。红穿破石具有清热利湿、利尿通淋、舒筋活络、盈补气血等功效，对泌尿系统结石具有特殊作用，可用于尿路感染、急慢性肾炎、肾结石的治疗，对于跌打损伤、月经不调、风湿疼痛等症状都有较好的治疗效果［4，5］。

红穿破石含有丰富的蒽醌类、黄酮类等成分，蒽醌类成分包括大黄素［6］、大黄素-6，8-二甲醚［6，7］、大黄酚［6］、1-羟基-6，7，8-三甲氧基-3-甲基蒽醌［7］、翼核果素［7］、翼核果醌［7］、鸢尾甙元［8］和羽扇豆醇［9］等。现有的质量标准有过对红穿破石大黄素及大黄素甲醚的定量分析［10，11］，但并不能较完全地反映红穿破石的质量，因此要建立能完全反映其质量的HPLC指纹图谱［12，13］。在传统用药和文献记载的药用部位中，红穿破石大多以地下部分的根及根茎作为药用部位，地上部分的茎和叶基本都被丢弃。现有的文献也有对红穿破石根及根茎的HPLC指纹图谱研究［14］，但其地上部分的HPLC指纹图谱研究较少，难以为红穿破石的质量评价提供较全面的参考。因此，建立红穿破石地上、地下部分HPLC指纹图谱，可为民族药红穿破石的质量评价和研究提供较全面的参考依据［15］。

1 仪器、药材与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪购自美国沃特世科技（上海）有限公司；D24UV型默克密理博超纯水一体化系统购自德国默克公司；Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱购自安捷伦科技有限公司；SQP型分析天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；大黄素对照品（批号：RP190519，纯度：99.66%）购自成都麦德生科技有限公司；甲醇色谱纯（批号：203511）、乙腈色谱纯（批号：204127）购自美国Fisher公司；水为去离子水。

试验所用红穿破石经广西中医药大学药用植物教研室郭敏副教授鉴定为鼠李科植物翼核果的干燥根、根茎、茎及叶，红穿破石样品信息见表1。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

分别称取红穿破石地上、地下部分粉末1.0 g，精密称定，精密加入甲醇各20 mL，称定重量，超声处理20 min，放冷，用甲醇补足重量，摇匀，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱采用Agilent ZORBX SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸；梯度洗脱如表2所示；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度考察精密称取红穿破石地上部分粉末1.0 g，连续进样6次，以13号峰的保留时间和峰面积为参照，其他12个共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.05%～0.54%，相对峰面积的RSD为0.05%～0.47%，均小于3.00%，说明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性考察精密称取红穿破石地上部分粉末1.0 g，平行制备6份，以13号峰的保留时间和峰面积为参照，其他12个共有峰相对保留时间的RSD为0.06%～0.43%，相对峰面积的RSD为0.96%～2.88%，均小于3.00%，说明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性考察取红穿破石地上部分供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h，以13号峰的保留时间和峰面积为参照，其他12个共有峰相对保留时间的RSD为0.07%～0.38%，相对峰面积的RSD为0.86%～2.66%，均小于3.00%，说明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3 结果与分析

3.1 共有峰的HPLC指纹图谱

本试验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件对10个产地红穿破石地上、地下部分HPLC色谱图进行分析，将10个产地红穿破石地上、地下部分峰面积均较大的色谱峰标定为共有峰，10个产地红穿破石地上、地下部分各标定有13个共有峰。为减少溶剂峰对试验结果造成的影响，将平均值法作为生成对照指纹图谱的方法，以0.5 min的时间宽度进行多点校正和Mark峰匹配，从而得到10个产地红穿破石地上、地下部分对照指纹图谱和各产地红穿破石地上、地下部分叠加图谱，见图1至图4。

3.2 大黄素的指纹图谱

大黄素是红穿破石的指标性成分，含量较高，峰面积稳定，地上部分13号峰、地下部分12号峰分别为指纹图谱参照峰，如图5所示。以指纹图谱中的地上部分13号峰（地下部分12号峰）为参照峰，分别计算10个产地红穿破石地上、地下部分的相对保留时间和峰面积，结果见表3至表6。

3.3 相似度分析

将10个产地红穿破石地上、地下部分的指纹图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，通过与红穿破石地上、地下部分的对照指纹图谱比较，得到不同产地的相似度结果。

由表7可知，10个产地红穿破石地上部分的相似度在0.823～0.979，但S4（广西钦州市钦北区贵台镇）、S8（广西防城港市防城区）2個产地的相似度均低于0.900，说明这2个产地与其他产地的红穿破石地上部分化学成分存在较大差异。10个产地红穿破石地下部分的相似度在0.712～0.945，其采收时间、环境、生长年限等存在差异。

3.4 聚类分析（HCA）

使用SPSS 20.0统计软件对10个产地红穿破石地上、地下部分进行系统聚类，采用组间联接法，以欧式距离平方和为度量标准，对地上部分和地下部分进行聚类［16，17］。

由图6a可知，当d=10时，红穿破石地上部分被分为2个聚群，其中S7为一类，S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1、S5、S10聚为一类；当d=4时，红穿破石地上部分被分为3个聚群，其中S5、S10聚为一类，S7为一类，S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1聚为一类。由此可见，红穿破石S7地上部分与其他样品存在明显差异，而S3、S4、S9、S2、S8、S6、S1、S5、S10样品的差异较小，化学成分较相似，综合质量较稳定。

由图6b可知，当d=20时，红穿破石地下部分被分为2个聚群，S4、S9、S1为一类，S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10聚为一类；当d=15时，红穿破石地下部分被分为3个聚群，S4、S9聚为一类，S1为一类，S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10聚为一类；当d=10时，红穿破石地下部分被分为4个聚群，S4、S9聚为一类，S1为一类，S8、S10聚为一类，S2、S6、S3、S7、S5聚为一类。由此可见，红穿破石S4、S9、S1地下部分与其他样品存在明显差异，而S2、S6、S3、S7、S5、S8、S10样品的差异较小，化学成分较相似，综合质量较稳定。

3.5 主成分分析

3.5.1 主成分提取分析为了综合评价红穿破石地上、地下部分的品质，将10个产地红穿破石地上、地下部分指纹图谱共有峰面积导入SPSS 20.0软件，并对数据进行标准化处理，使用标准化后的数据进行主成分分析［18-21］。主成分分析（PCA）结果见表8。

红穿破石地上、地下部分PCA碎石图（图7）表明，地上部分前3个成分、地下部前6个成分特征值均较大，累计方差贡献率分别为99.412%、96.173%，说明地上部分前3个成分和地下部分前6个成分为主要成分，包含了药材指纹图谱大部分信息，其他成分包含信息较少。本研究以特征值大于1为提取标准，地上部分前2个成分、地下部分前4个成分符合要求，累计方差贡献率分别为98.115%、85.035%，因此分别选择地上部分前2个成分和地下部分前4个成分作为红穿破石的主要成分。

3.5.2 特征向量与主成分模型为得到所选取的地上部分前2个主成分（A1、A2）和地下部分前4个主成分（B3、B4、B5、B6）公因子的表达式，以各自主成分载荷量除以各自主成分特征值的算术平方根得到特征向量，如表9所示。其中主成分载荷矩阵主要反映了各变量对主成分的贡献大小及作用方向，且绝对值越大表示相关性越密切。

用F1、F2、F3、F4、F5、F6分别代表6个公因子，Z1至Z13分别代表正态变换后的标准化数据，可得各主成分公因子表达式。

地上部分前2个主成分公因子表达式如下：

F1=0.290Z1+0.910Z2+0.290Z3+0.290Z4+0.290Z5+0.290Z6+0.170Z7+0.290Z8+0.290Z9+0.270Z10+0.270Z11+0.270Z12+0.280Z13 （1）

F2=-0.140Z1-0.140Z2-0.120Z3-0.170Z4+0.050Z5-0.100Z6+0.750Z7-0.110Z8-0.020Z9+0.350Z10+0.370Z11-0.230Z12-0.140Z13 （2）

地下部分前4個主成分公因子表达式如下：

F3=0.230Z1+0.390Z2+0.180Z3+0.290Z4+0.230Z5+0.300Z6+0.380Z7-0.290Z8+0.090Z9+0.220Z10+0.190Z11-0.230Z12-0.390Z13 （3）

F4=0.130Z1-0.090Z2-0.400Z3+0.170Z4+0.010Z5-0.360Z6-0.210Z7+0.260Z8+0.370Z9+0.410Z10+0.360Z11-0.330Z12-0.040Z13 （4）

F5=0.540Z1-0.180Z2-0.010Z3-0.020Z4+0.580Z5-0.050Z6-0.140Z7+0.290Z8-0.280Z9-0.100Z10-0.330Z11-0.140Z12-0.130Z13 （5）

F6=0.140Z1-0.003Z2+0.390Z3-0.130Z4+0.230Z5+0.310Z6-0.060Z7+0.400Z8+0.340Z9+0.150Z10+0.330Z11+0.430Z12+0.260Z13 （6）

将主成分因子占所提取主成分总特征值之和的比例作为权重系数，得到主成分综合模型M。

地上部分主成分综合模型M1的表达式如下：

M1=α1×F1+α2×F2 （7）

式中，α为主成分贡献率；α1=0.890 4；α2= 0.090 8。

地下部分主成分综合模型M2的表达式如下：

M2=α1×F1+α2×F2+α3×F3+α4×F4 （8）

式中，α1=0.398 9；α2=0.215 0；α3=0.138 5；α4=0.097 9。

3.5.3 10个产地红穿破石地上、地下部分主成分综合评价针对主成分对红穿破石地上、地下部分进行综合评价，按照主成分公因子的表达式及主成分综合模型M计算10个产地红穿破石地上部分和地下部分的综合得分。

由表10、表11可知，10个产地红穿破石地上部分的综合评分排名由高到低依次为HCPS-1、HCPS-7、HCPS-9、HCPS-4、HCPS-2、HCPS-6、HCPS-8、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-5。10个产地红穿破石地下部分的综合评分排名由高到低依次为HCPS-5、HCPS-7、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-1、HCPS-6、HCPS-2、HCPS-8、HCPS-9、HCPS-4。

4 小结与讨论

已有文献对红穿破石药用部分（即地下部分）进行指纹图谱分析［14］，本试验建立了红穿破石地上、地下部分HPLC指纹图谱分析方法，该方法可以同时对10个产地的红穿破石地上、地下部分进行测定，并运用指纹图谱相似度分析、聚类分析和主成分分析［22］ 3种方法对其进行评价。其中，供试品考察了不同溶剂、溶剂比例、液料比、时间、温度等样品处理方法，考察了不同流动相、流速、柱温、波长、色谱柱等色谱条件，最终确定红穿破石样品处理方法及色谱条件。

本试验建立了红穿破石地上、地下部分HPLC指纹图谱的检测方法，经与对照品比对分析，鉴定并指认了红穿破石地上、地下部分的大黄素成分。红穿破石中除大黄素外，还有已知的大黄酚、大黄素甲醚等蒽醌类成分及翼核果素、翼核果醌。课题组前期研究发现大黄酚、大黄素甲醚在红穿破石地上、地下部分含量较低且翼核果素及翼核果醌对照品难以获取，大黄素在色谱图上响应值高、分离度较好、稳定性良好，因此以大黄素为参照峰更具有代表性。

本研究对10个产地红穿破石地上部分与地下部分的指纹图谱共有峰面积进行了主成分分析，结合碎石图提取了地上部分前2个成分作为主成分，主成分A1、主成分A2的方差贡献率分别为89.037%、9.078%，累计方差贡献率为98.115%；提取了地下部分前4个成分作为主成分，主成分B1、主成分B2、主成分B3、主成分B4的方差贡献率分别为39.894%、21.495%、13.853%、9.793%，累计贡献率为85.035%。根据主成分综合得分模型，对10个产地红穿破石地上部分与地下部分进行综合评价，地上部分的综合评分排名由高到低依次为HCPS-1、HCPS-7、HCPS-9、HCPS-4、HCPS-2、HCPS-6、HCPS-8、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-5。10个产地红穿破石地下部分的综合评分排名由高到低依次为HCPS-5、HCPS-7、HCPS-10、HCPS-3、HCPS-1、HCPS-6、HCPS-2、HCPS-8、HCPS-9、HCPS-4。综上，HCPS-7（广西桂林市平乐县）的综合质量更优。

受取样环境的影响，本研究的药材选取产地较少，且均来源于广西，具有地域性，代表性不足，使得结果具有一定的局限性。后续将采集不同省份、不同地区以及不同采收期的红穿破石，对红穿破石地上、地下部分进行深入的分析。此外，红穿破石中很多化学成分尚不明确，有待进一步研究。

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