补骨脂盐炙前后HPLC指纹图谱的比较

时间：2024-05-23

魏子涵王文琦赵泽林张诗涵张丽艳李军马四补

摘要：建立補骨脂（Psoralea corylifolia L.）盐炙前后的高效液相（ HPLC）指纹图谱，并采用化学计量学方法评价生品补骨脂、盐补骨脂的差异。采用HPLC法建立指纹图谱，色谱柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为290 nm。采用镜像对比、偏最小二乘判别（PLS-DA）、相似性评价分析方法进行数据分析。成功建立了生品补骨脂、盐补骨脂的HPLC指纹图谱，共确定14个共有峰，并指认了补骨脂素、异补骨脂素2种成分。生品补骨脂相似度良好，盐炙后的补骨脂相似度发生变化。镜像分析结果表明，盐炙后的补骨脂HPLC指纹图谱与生品补骨脂存在差异。与生品补骨脂相比，盐补骨脂的1～14号峰均有不同程度的增加。PLS-DA分析结果表明，生品补骨脂与盐补骨脂在化学成分上存在差异。建立的指纹图谱方法重复性、稳定性良好，可为补骨脂盐炙前后的鉴别及质量分析提供参考。

关键词：补骨脂（Psoralea corylifolia L.）；生品补骨脂；盐炙补骨脂；HPLC指纹图谱；偏最小二乘法（PLS-DA）

中图分类号：R286 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0171-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.031 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparison of HPLC fingerprints of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting

WEI Zi-han， WANG Wen-qi， ZHAO Ze-lin，ZHANG Shi-han，ZHANG Li-yan，LI Jun，MA Si-bu

（School of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting was established， and the differences between raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. were evaluated by using chemometric methods. HPLC method was used to establish the fingerprint， and the chromatographic column was Waters Symmetry C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm）. The flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 30 ℃， the injection volume was 10 μL， and the detection wavelength was 290 nm. Data analysis was conducted using mirror comparison， partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）， and similarity evaluation analysis methods. HPLC fingerprints of raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. were successfully established， identified a total of 14 common peaks were， and determined two components， psoralen and isopsoralen， were identified. Raw Psoralea corylifolia L. had good similarity， and the similarity of Psoralea corylifolia L. after salt roasting changed. The mirror analysis results indicated that there were differences in the HPLC fingerprint of Psoralea corylifolia L. after salt roasting compared to raw Psoralea corylifolia L.. Compared with raw Psoralea corylifolia L.， the peaks 1～14 of salted Psoralea corylifolia L. had increased to varying degrees. The PLS-DA analysis results indicated that there were differences in chemical composition between raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. The established fingerprint method had good repeatability and stability， and could provide reference for the identification and quality analysis of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting.

Key words： Psoralea corylifolia L.； raw Psoralea corylifolia L.； salted Psoralea corylifolia L.； HPLC fingerprint； partial least squares method （PLS-DA）

补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实，始载于《开宝本草》，具有温脾止泻、纳气平喘、温肾助阳的功效，临床上用于诊治命门火衰、肾虚所致的小便清涩、腰膝酸冷、遗尿等中医病症［1］。补骨脂药用始载于南北朝雷敩著的《雷公炮炙论》，言其性本大燥、毒，并记载其修治之法。最早记载其功效的是《药性论》，但该古籍没有补骨脂相关炮制方法的记录。盐炙法初现于宋代，宋代《局方》中记载了盐炙补骨脂，此方法可以缓和补骨脂的燥性［2-5］。补骨脂生品性燥，临床上多用其炮制品内服，目前盐炙法已被《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版收录［6］。补骨脂经过盐炙后入药，不但能够缓和其原本的燥性，还可以引药入肾，增强补肾纳气的作用［7-9］。

药材饮片的质量好坏关系着治疗效果，补骨脂相关质量标准始终是学者的研究热点；补骨脂主要含有黄酮类、香豆素类和单萜类化合物［10-13］。通过数据库搜索发现大量文献集中在香豆素成分的活性上，现已证实补骨脂具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎、抗氧化等多种药理作用［14，15］，研究价值较高。2020年版《中国药典》以补骨脂素、异补骨脂素作为补骨脂与盐补骨脂有效成分含量控制指标，而指纹图谱研究方法始终没有标准。因此，本研究拟对补骨脂盐炙前后HPLC指纹图谱进行比较，以期为阐明补骨脂盐灸前后的鉴别及其质量标准建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

补骨脂饮片由国药集团同济堂（贵州）制药有限公司提供，经贵州中医药大学生药学教研室王波老师鉴定为补骨脂，其产地及批次见表l。

补骨脂素对照品（批号：110739-201918，中国食品药品检定研究院，纯度＞98%）、异补骨脂素对照品（批号：110738-202016，中国食品药品检定研究院，纯度＞98%）、正乙烷（批号：20180703，天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（批号：0410107，上海化學试剂有限公司）、甲醇为色谱纯（批号：20211101，天津科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

Model 9960D型超声波清洗机（天津科贝尔公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）；AUW120D型电子分析天平、101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；JP2-160型电子分析天平（日本CHYOBANCE公司）；SX-4-10型箱式电阻炉（天津市泰斯特仪器有限公司）；Waters2695型液相色谱仪（美国沃特世公司）。

1.3 方法

1.3.1 盐补骨脂饮片在164 ℃的温度下闷润生品补骨脂2 h，加2.65%NaCl，置炒药机中炒制15 min，放凉即得盐补骨脂饮片。盐补骨脂饮片编号为Y1至Y15，分别对应生品补骨脂饮片（S1至S15）。

1.3.2 对照品溶液的制备精密称取补骨脂素对照品4.60 mg，用甲醇溶解于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即为对照品储备液。精密吸取对照品储备液50 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其浓度为0.023 mg/mL，即为补骨脂素对照品溶液。

精密称取异补骨脂素对照品6.20 mg，用甲醇溶解于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即为对照品储备液。精密吸取对照品储备液50 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其浓度为0.031 mg/mL，即为异补骨脂素对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备精密称取0.5 g的补骨脂样品粉末，置索氏提取器中，加甲醇70 mL，加热回流提取2 h，放冷，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

1.3.4 色谱条件色谱柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，柱号：0329301321）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：290 nm。洗脱程序如表2所示。

1.3.5 指纹图谱方法学考察

1）精密度试验。取同一批补骨脂样品，按“1.3.3”项方法制备供试品溶液，在“1.3.4”项色谱条件连续进样6针，记录色谱图。

2）稳定性试验。补骨脂供试品溶液室温放置，分别在0、3、6、9、12、15 h 按照“1.3.4”项色谱条件进样测定，记录色谱图。

3）重复性试验。取同一批补骨脂0.5 g，精密称定，共6份，按照“1.3.3”项方法制备供试品溶液，按照“1.3.4”项色谱条件进样测定，记录色谱图。

2 结果与分析

2.1 精密度试验结果

在色谱图中，4号峰分离度较好，故以4号峰为参照峰计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。共有峰相对保留时间见表3，相对峰面积见表4，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.011 5%～0.066 4%，相对峰面积的相对标准偏差为0.108 9%～0.778 8%，表明仪器精密度良好。

2.2 稳定性试验结果

以4号峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。由表5、表6可知，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0.032 3%～0.191 3%，相对峰面积的相对标准偏差为0.053 4%～0.166 9%，表明样品在室温15 h内稳定性良好。

2.3 重复性试验结果

以4号峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。由表7、表8可知，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0.012 8%～0.157 4%，相对峰面积的相对标准偏差为0.055 6%～1.154 3%。表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱结果与分析

2.4.1 指纹图谱结果按“1.3.4”项的色谱条件分别采集15批生品补骨脂、盐补骨脂样品的色谱图，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012年版），采用中位数法和多点校正法生成相应的对照图谱，得到14个共有峰。生品补骨脂、盐补骨脂样品的指纹图谱见图1、图2。

2.4.2 镜像分析对比分析将“2.4.1”项中生品补骨脂（S1）和盐补骨脂（Y1）的指纹图谱进行镜像对比（图3），结合其指纹图谱峰面积进行分析，生品补骨脂和盐补骨脂有一定区别。与生品补骨脂相比，盐补骨脂的1～14号峰均有不同程度的增加。

2.4.3 指纹图谱相似度分析将生品补骨脂（S1）和盐补骨脂（Y1）的色谱图经过中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照指纹图谱，见图4、图5，根据色谱峰的分离度与信号强度标定出14个色谱峰的共有峰，依次进行色谱峰的编号。通过与图6、图7中2种对照品指纹图谱的保留时间比对，表明指纹图谱共有峰中的4号峰（保留时间18.4 min）为补骨脂素，5号峰（保留时间19.5 min）为异补骨脂素。

15批生品补骨脂饮片的相似度分别为0.985、0.997、0.983、0.977、0.999、0.999、0.986、0.966、0.963、0.999、0.963、0.997、0.996、0.992、0.985。相似度分析结果显示，生品补骨脂的指纹图谱相似度良好。

15批盐补骨脂饮片的相似度分别为0.979、0.985、0.972、0.965、0.997、0.971、0.940、0.944、0.918、0.999、0.958、0.954、0.925、0.983、0.993。结果表明，补骨脂炮制过程中的化学成分含量会发生变化，炮制后相似度发生明显改变。

2.4.4 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）将15批生品补骨脂、盐补骨脂样品共有峰峰面积导入SIMCA软件，对其进行PLS-DA分析，结果如图8所示。模型拟合参数 R2X=0.960，R2Y=0.483，模型预测参数 Q2=0.122。結果表明，蓝色五角星表示生品补骨脂，红色五角星表示盐补骨脂，各点以中心线为中心，分别分布在其左右两侧，左侧部分主要为生品补骨脂，右侧部分主要为盐补骨脂。其中，S8号、S13号生品补骨脂较离散，Y8、Y13号盐补骨脂较离散。生品补骨脂与盐补骨脂在化学成分上存在明显差异。

3 小结

本研究采用HPLC建立生品补骨脂、盐补骨脂指纹图谱，较全面地反映补骨脂盐炙后的化学成分信息。采用相似度及镜像分析比较生品与盐炙品的HPLC指纹图谱，虽含有相同的14个共有峰，但仍有一定差异。与生品补骨脂相比，盐补骨脂的1～14号峰均有不同程度的增加。采用最小偏二乘法分析证实生品补骨脂与盐补骨脂在化学成分上存在差异。本研究结果为进一步探讨补骨脂盐炙后的炮制作用，制定补骨脂盐炙品的质量标准提供了参考依据。本研究具备了定性鉴别和定量测定的双重作用，提高了中药材的内在质量控制水平，为不同化学计量方法与质量评价提供了参考依据。

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