不同核数的灵芝菌丝体转录组比较分析

王红丽 杨扬 胡学博

摘要：以野生靈芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）的菌丝体为材料，利用高通量测序技术筛选差异表达基因，并进行GO分析和KEGG富集分析。通过差异基因分析，筛选出568个差异表达基因。GO分析结果表明，野生灵芝（D）与自然单核灵芝（Mo）菌丝体的差异表达基因主要富集在转录调控及DNA模板化、tRNA氨酰化、组蛋白甲基化等过程；野生灵芝（D）与双核灵芝（Mu）菌丝体的差异表达基因主要富集在染色质沉默、L-丝氨酸代谢、硫化合物代谢等过程；自然单核灵芝（Mo）与双核灵芝（Mu）菌丝体的差异表达基因主要富集在染色质沉默、DNA模板转录、谷氨酸分解等过程。KEGG富集结果表明，自然单核灵芝（Mo）与双核灵芝（Mu）菌丝体在代谢通路上有明显的差异，差异基因主要被注释到过氧化物酶、维生素代谢等通路。野生灵芝（D）与自然单核灵芝（Mo）菌丝体、野生灵芝（D）与双核灵芝（Mu）菌丝体的差异基因并没有KEGG富集的结果，说明其代谢通路没有明显差异。筛选出3个品系中表达量差异均显著的基因，共12个，并对基因的主要功能进行预测。12个基因中有5个基因可以匹配到GO库。GO注释结果表明，这5个基因主要被注释到氧化还原酶活性、金属离子结合、膜的调控与膜组成等方面。

关键词：灵芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］；转录组；菌丝体核数

中图分类号：S567.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）12-0200-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.035 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparative analysis of transcriptome of Ganoderma lucidum mycelium with different nuclear numbers

WANG Hong-li， YANG Yang， HU Xue-bo

（College of Plant Science and Technology/Institute of Medicinal Plants/Innovation China & the Belt and Road International Institute for Industrial Science and Technology Innovation of Traditional Chinese Medicinal Materials/National and Local Joint Engineering Research Center for Medicinal Plant Breeding and Cultivation/Hubei Engineering Research Center for Medicinal Plants， Huazhong Agricultural University，Wuhan  430070， China）

Abstract： Using the mycelium of wild Ganoderma lucidum ［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］（D）， natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo）， and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） as materials， high-throughput sequencing technology was used to screen differentially expressed genes， and GO analysis and KEGG enrichment analysis were conducted. Through differential gene analysis， 568 differentially expressed genes were screened. The GO analysis results showed that the differentially expressed genes between wild Ganoderma lucidum （D） and natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） hyphae were mainly enriched in transcriptional regulation， DNA templating， tRNA aminoacylation， and histone methylation processes；the differentially expressed genes in the mycelium of wild Ganoderma lucidum （D） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） were mainly enriched in processes such as chromatin silencing， L-serine metabolism， and sulfur compound metabolism；the differentially expressed genes in the mycelium of natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） were mainly enriched in processes such as chromatin silencing， DNA template transcription， and glutamate decomposition. The KEGG enrichment results indicated that there were significant differences in the metabolic pathways between natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） mycelium， with differential genes mainly annotated into pathways such as peroxidase and vitamin metabolism.The differential genes between wild Ganoderma lucidum （D） and natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） mycelium， as well as between wild Ganoderma lucidum （D） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） mycelium， did not show KEGG enrichment， indicating no significant differences in their metabolic pathways. A total of 12 genes with significant differences in expression levels were selected from 3 strains， and the main functions of the genes were predicted.Out of 12 genes， 5 genes could be matched to the GO library. The GO annotation results indicated that these 5 genes were mainly annotated in aspects such as oxidoreductase activity， metal ion binding， membrane regulation， and membrane composition.

Key words： Ganoderma lucidum ［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］； transcriptome； mycelial nucleus number

灵芝是多孔菌科真菌灵芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］的子实体，隶属于担子菌亚门伞菌纲多孔菌目多孔菌科灵芝属［1］。灵芝在中国用药历史悠久，是一种典型的药食两用真菌［2］。研究发现，多糖和灵芝酸是灵芝的主要功能代谢物，具有抗氧化和抗炎功能［3-6］。研究人员从灵芝菌丝体中分离得到了多种生物活性成分，主要包括多糖、三萜、蛋白质、甾醇等。随着对灵芝活性成分研究的不断深入，其药用价值也不断被发现。已有研究发现灵芝中所含的活性成分具有多种功效，其中包括抗肿瘤、抗炎、抗衰老、免疫调节、调节血压、保护肝功能、治疗皮肤病以及降血糖等作用［7-10］。

叶丽云等［11］在灵芝单、双核菌丝体差异研究的试验中发现双核菌株三萜含量显著高于单核菌株，且荧光定量PCR结果显示双核菌株的6个三萜关键酶的表达量显著高于单核菌株，表明基因表达可能存在协调增效作用。连瑞丽等［12］在灵芝单、双核菌丝体液体发酵产多糖量的比较研究中发现单核菌丝体的多糖产量高于双核菌丝体。

多倍体育种是微生物中常用的一种育种方式［13］。在野生灵芝（D）的基础上，通过培养皿原生质体分离获得了自然单核灵芝（Mo），通过秋水仙碱诱变获得了双核灵芝（Mu）。转录组是基因组遗传信息与蛋白质组各种生物功能之间连接的重要纽带，可以通过分析转录本的结构和表达水平在基因表达的层面上对生物体调控机制等进行研究，从而揭示生物体的基因表达、研究结构的变异及发现新基因等［14，15］。本研究对野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）3个菌株进行了RNA-Seq高通量测序，再通过生物信息学方法分析，找出了3个不同灵芝品系之间的差异基因。通过不同品系灵芝两两之间的转录组比较分析，找出表达量差异显著的基因，并对其基因功能进行注释，预测其可能的功能，为相关代谢组的比对和功能验证提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）均来自华中农业大学植物科学技术学院药用植物研究所。D、Mo、Mu 3个菌株均测3次RNA，分别记为D1、D2、D3、Mo1、Mo2、Mo3、Mu1、Mu2、Mu3。

1.1.2 仪器 Master-R型超纯水机（上海和泰仪器有限公司），ZQWY-200型振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司），SPX-150BIII型生化培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），电热恒温培养箱（金坛市易晨仪器制造有限公司），JY6002型电子天平（上海舜宇恒科学仪器有限公司），DYY2C型电泳仪（北京六一仪器厂），DL-5M型低温离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司），NanoDrop 2000型分光光度计［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］。

1.1.3 试剂 葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、酵母粉（英国OXOID公司）；七水合硫酸镁、异丙醇（分析纯，上海国药集团化学试剂公司）；75%乙醇、氯仿。

1.2 方法

灵芝菌丝体的培养方法参照文献［16］。将培养好的灵芝菌丝体接种在PDA培养基上，25 ℃摇床暗培养3～4 d。

1.3 RNA提取与高通量测序

取100 mL灵芝发酵液，采用TRIzol法提取RNA。检测合格的样品采用 Illumina HiseqTM 2500 进行高通量测序，原始数据过滤除杂。

1.4 数据分析

使用DESeq2软件（http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）筛选差异基因，筛选条件为Padj<0.05且|log2（FC）|>1。

采用Fastqc（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對RNA原始测序数据进行快速评估，分析其接头片段。并进一步用Trimmomatic（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Trimmomatic.html）过滤接头片段。采用Gfold（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Gfold.htm）分析基因定量表达和筛选基因表达差异。采用Hisat2（https：//bioconductor.org/packages/release /bioc/html/Hisat2.htm）将参考基因组与转录组进行比对。TBtools用于GO富集分析。使用BLAST软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=PRJNA71455）进行相似性检索。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计与处理

2.1.1 原始测序数据分析 本研究获得高通量RNA测序的原始数据，每个样品数值较接近，表明重复性较好。测序结果中每个样品都有接头，并且每个接头片段均无差异，后续分析过程中对原始数据进行处理，去除低质量碱基或未能识别的碱基。

使用Fastqc软件对测试数据进行质量分析，再使用multiQC软件对所有结果进行组合。利用Trimmomatic软件对原始数据进行去杂处理，并对碱基进行合适的修改，得到的reads质量统计结果如表1所示，样品总体质量较好，仅有少数片段（<0.3%）是低质量碱基序列，表明可以对数据进行进一步研究。

2.1.2 测序结果预处理 将过滤处理后的序列与灵芝参考基因组进行比对，结果如表2所示，D、Mo、Mu基因组与灵芝参考基因组的比对率为84.06%～86.65%。并且转录组序列比对到参考基因组的唯一比对数较多，唯一比对率也较高，为64.07%～66.82%。

利用Gfold软件对样品进行count计数，并且利用R包对其进行相关性分析，结果如图1所示，每个样品的相似度均超过0.93，证明原始数据可靠，可以运用该数据进行后续的基因差异分析以及功能富集分析。

2.2 基因差异性表达分析

通过R包上的DESeq2软件进行基因的差异分析，统计样品间的差异基因，由图2可知，野生灵芝（D）菌丝体与自然单核灵芝（Mo）菌丝体差异基因比较中上调基因有110个，下调基因有67个；野生灵芝（D）菌丝体与双核灵芝（Mu）菌丝体差异基因比较中上调基因有117个，下调基因有89个；自然单核灵芝（Mo）菌丝体与双核灵芝（Mu）菌丝体差异基因比较中上调基因有86个，下调基因有99个。利用Excel软件进行差异基因的比较，并对基因以FPKM进行表达丰度检测（表3），对所有基因在野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）菌丝体中的表达进行差异显著性分析，筛选出灵芝菌丝体中共有的差异基因，分别为GL23181-R1，GL15298-R1，GL15297-R1，GL20735-R1，GL17872-R1，GL17848-R1， GL17191-R1，GL28818-R1，GL19837- R1，GL23330-R1，GL18253-R1，GL15569-R1。

2.3 差异表达基因的GO分析

根据基因组序列进行GO注释，使用EggNOG功能注释数据库，得到注释结果后利用TBtools软件进行GO富集分析，结果如图3所示。

野生灵芝（D）菌丝体与自然单核灵芝（Mo）菌丝体的基因功能主要富集到转录调控及DNA模板化（Regulation of transcription，DNA-templated）、tRNA氨酰化（Lysyl tRNA aminoacylation）、氧化還原过程（Oxidation-reduction process）、发病机理（Pathogenesis）、硫氨基酸代谢过程（Sulfur amino acid metabolic process）、组蛋白甲基化（Histone H3-K36 methylation）等过程，且发病机理（Pathogenesis）较显著，富集到转录调控及DNA模板化（Regulation of transcription，DNA-templated）和氧化还原过程（Oxidation-reduction process）中的基因数目较少。野生灵芝（D）菌丝体与双核灵芝（Mu）菌丝体的基因功能主要富集到染色质沉默（Chromatin silencing）、L-丝氨酸代谢过程（L-serine metabolic process）、蛋白脱乙酰作用（Protein deacetylation）、蛋白质在核糖体的合成（Protein import into peroxisome matrix）、硫化合物代谢（Sulfur compound metabolic process）过程，且富集结果显著。自然单核灵芝（Mo）菌丝体与双核灵芝（Mu）菌丝体的基因功能主要富集到染色质沉默（Chromatin silencing）、DNA模板转录（DNA-templated transcription，elongation）、谷氨酸分解（Glutamate catabolic process to 2-oxoglutarate）、组蛋白甲基化（Histone H3-K36 methylation）、L-丝氨酸代谢过程（L-serine metabolic process）、发病机理（Pathogenesis）、蛋白脱乙酰作用（Protein deacetylation），且发病机理（Pathogenesis）较显著。根据野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）菌丝体的基因功能富集结果可以看出，灵芝菌丝体经过染色体加倍之后，富集的通路数有所减少，但各通路的显著程度较高。

2.4 差异表达基因的KEGG富集分析

经KEGG注释之后，利用TBtools工具进行KEGG富集分析。由图4可知，自然单核灵芝（Mo）菌丝体与双核灵芝（Mu）菌丝体在代谢通路上有明显的差异，差异基因主要被注释到过氧化物酶（Peroxisome）、维生素代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、代谢（Metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、染色体及相关蛋白（Chromosome and associated proteins）通路中。野生灵芝（D）菌丝体与自然单核灵芝（Mo）菌丝体、野生灵芝（D）菌丝体与单核加倍得到的双核灵芝（Mu）菌丝体的差异基因并没有KEGG富集的结果，表明野生灵芝（D）菌丝体和单核灵芝（Mo）菌丝体以及双核灵芝（Mu）菌丝体之间代谢通路无明显差异。

2.5 差异基因主要功能预测

通过基因差异性表达分析筛选出了12个基因，利用BLAST2GO软件对差异基因进行生物大分子序列比对分析，从而找出12个差异基因主要的生理功能及作用。序列对比分析结果如表4所示，12个差异基因均能通过生物大分子序列比对（BLAST）匹配到蛋白质数据库（Nr）。根据Nr注释结果可以看出12个基因中，某些基因可能与细胞色素P450（Cytochrome P450）、真菌疏水蛋白（Fungal hydrophobin）、WD40重复样蛋白（WD40 repeat-like protein）相关，但也有一些基因可能与功能未知的蛋白质有关。

利用Blast2GO軟件将12个基因的Nr注释结果转换为GO注释，结果如表5所示。发现在12个基因中有5个基因可以匹配到GO库，分别为GL23181- R1、GL15297-R1、GL15298-R1、GL17191-R1和GL18253-R1。根据GO注释结果可以看出，5个基因的主要功能是氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、金属离子结合（Metal ion binding）、细胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、细胞外区域（Extracellular region）、真菌性细胞壁（Fungal-type cell wall）、转录调控及DNA模板化（Regulation of transcription， DNA-templated）、膜（Membrane）、膜的调控与膜组成（Integral component of membrane）。并且金属离子结合在基因GL23181-R1、GL17191-R1中均存在；细胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、细胞外区域（Extracellular region）、真菌性细胞壁（Fungal-type cell wall）在基因GL15297-R1、GL15298-R1中均存在，表明与灵芝菌丝体核数有关的基因可能功能是调控细胞壁的组分，调控与金属离子结合等。

3 小结与展望

本研究利用转录组测序技术，分析了不同核数灵芝的基因表达变化。对野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）的菌丝体进行了RNA高通量测序，并对基因进行了差异分析。筛选出了12个差异显著的基因，分别为GL23181-R1，GL15298-R1，GL15297-R1，GL20735-R1，GL17872-R1，GL17848-R1，GL17191-R1，GL28818-R1，GL19837- R1，GL23330-R1，GL18253-R1，GL15569-R1。Nr注释结果表明，在12个基因中某些基因可能与细胞色素P450（Cytochrome P450）、真菌疏水蛋白（Fungal hydrophobin）、WD40重复样蛋白（WD40 repeat-like protein）相关，但也有一些基因可能与功能未知的蛋白质有关。GO注释结果表明，差异基因的主要功能是氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、金属离子结合（Metal ion binding）、细胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、细胞外区域（Extracellular region）、真菌性细胞壁（Fungal-type cell wall）、转录调控及DNA模板化（Regulation of transcription， DNA-templated）、膜（Membrane）、膜的调控与膜组成（Integral component of membrane）。

单核灵芝菌丝体与双核灵芝菌丝体的差异研究发现，双核灵芝菌丝体的三萜含量高于单核灵芝菌丝体，多糖含量低于单核灵芝菌丝体［6］。对不同核数灵芝菌丝体进行转录组差异分析，在野生灵芝（D）、自然单核灵芝（Mo）、双核灵芝（Mu）菌丝体的差异基因中，筛选出12个表达量均差异显著的基因，并对其生物学功能［17-19］进行预测。后续可对相应的代谢组与转录组分析结果进行整体分析和验证，从分子水平验证基因的功能，明确控制灵芝菌丝体核数的主要基因［20］。未来可在该基因的基础上，创制突变体，将其应用于灵芝种植，以降低成本，指导生产，提高灵芝的经济价值。

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