溶菌酶和抗生素对肉鸡组织IGF-ⅠmRNA的影响

武汉新华扬生物股份有限公司 程时军 张 伟

华中农业大学动物营养系 马立保*

胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）是机体发育中必不可少的生长激素（Daughaday和Rotwein，1989）。研究表明，IGF-Ⅰ主要由肝脏合成分泌，其在畜禽血液中的含量与体增重呈正相关（Beccavin等，2001），是促进肉鸡生长的主要因子（Frank 等，1998）。 Hathaway 等（1996）报道，饲喂抗生素可使畜禽血清中的IGF-Ⅰ含量增加，从而促进畜禽生长。本试验以溶菌酶替代抗生素使用，探讨溶菌酶对肉鸡体组织IGF-ⅠmRNA表达的影响，并简要探讨了溶菌酶可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料 1日龄艾维因肉鸡144只，购自武汉正大有限公司。

溶菌酶酶活性为500000 U/g，由武汉某公司提供，其酶活单位定义为：在25℃、pH为6.2的条件下，于450 nm处每分钟引起溶酶小球菌体溶液吸光度下降0.001为1个酶活力单位（U）。

1.2 主要仪器及试剂 仪器：超净工作台（北京东联哈尔仪器有限公司）、组织样本破碎机（Fast-Prep-24）、离心机（eppendorf centrifuge 5415R）、基因扩增仪（东胜创新EDC-810）、电泳仪（北京六一仪器厂DYY-7C型）、成像系统（AlphaImager EP）及实时 PCR 系统（Applied Biosystems 7500）。

试剂：TRIzol试剂、脱氧核（糖核）苷、DNA 多聚酶、AMV反转录酶、核糖核酸分解酶抑制剂、缓冲液、随机引物，荧光定量PCR试剂盒（SYBR green，含ROX内参染料）。

1.3 试验设计 采用单因子试验设计，分4个处理组：（1）对照组，饲喂不含抗生素的基础日粮；（2）抗生素组，饲喂含抗生素（有效成分为杆菌肽锌和硫酸粘杆菌素，在日粮中的含量分别为20 mg/kg和4 mg/kg）的基础日粮；（3）溶菌酶组1，饲喂含溶菌酶 150 mg/kg的基础日粮；（4）溶菌酶组2，饲喂含溶菌酶300 mg/kg的基础日粮。每组6重复，每重复6只，公母各半。试验日粮参照NY/T 33-2004配制玉米-豆粕型粉料，各阶段基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4 饲养管理 试验于2008年11月20日至12月31日在湖北省饲料检测站动物试验房内进行，分0～21 d和22～42 d两阶段地面平养；室内温度按饲养标准控制；在2～3周龄时以地克珠利饮水防球虫病。免疫程序为：7 d用新城疫Lasota+传染性支气管炎H120二联苗滴鼻、点眼；分别于14 d和21 d时IBD饮水。

1.5 样品收集及处理 于42日龄清晨从各处理中随机选取6只鸡（每重复1只），翅静脉采血，再屠宰取肝脏及一侧胸肌各5 g左右用锡箔纸包好编号迅速置入液氮灌冷冻，转到-80℃冰箱保存待用。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 RNA的提取 取适量组织于研钵加液氮研磨，再取 100 μL 研磨液，加入 500 μL TRIzol，室温放置10 min，加入 100 μL氯仿，并剧烈振荡5 s，室温放置5 min。12000 r/min低温离心15 min，取上清 200 μL，加 200 μL 异丙醇，冰盒上放置15 min。12000 r/min低温离心10 min，沉淀用75%乙醇洗涤1次，低温离心（8000 r/min，8 min）后弃上清液，风干后沉淀用DEPC水溶解，-80℃保存备用或立即进行反转录。

1.6.2 反转录反应 反转录反应体系见表2。反应程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min，1个循环，4℃结束。产物-20℃保存备用或立即进行RT-qPCR。

表2 反转录反应体系（10 μL）

1.6.3 引物设计、合成和检测 本试验用内参基因β-actin的引物参照马莉等（2007）方法，用Primer-BLAST为IGF-Ⅰ设计引物，序列见表3。

表3 试验用引物序列

1.6.4 荧光定量PCR反应 反应体系总体积为20 μL，待检样品和内参基因样品均参照表4的反应体系进行。反应程序：95℃2 min，1个循环，然后95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 个循环。1.7 数据统计分析 试验数据用平均数±标准差表示，采用SPSS 16.0软件进行ONE-WAYANOVA分析，并以LSD作多重比较。

表4 荧光定量PCR反应体系（20 μL）

2 结果与分析

溶菌酶对42 d肉鸡肝脏和胸肌IGF-ⅠmRNA的影响结果见表5。

表5 溶菌酶对42日龄肉鸡肝脏和胸肌IGF-ⅠmRNA的影响

从表5可以看出，抗生素组较对照组肝脏IGF-Ⅰ mRNA水平显著提高了 18.8%（P＜0.05），2个溶菌酶组也较对照组分别提高12.5%和10.4%；2个溶菌酶组及抗生素组间差异不显著（P＞0.05）；抗生素和2个溶菌酶组胸肌IGF-ⅠmRNA水平较对照组有提高的趋势，但无显著差异（P ＞ 0.05）。

3 讨论

IGF-Ⅰ可以通过旁分泌及自分泌来参与促进机体的生长发育、营养代谢及肌细胞分化（Perrone，1995；Widmer 等 ，1985；Schmid 等 ，1983）。Beccavin等（2001）发现鸡的生长速度与肝脏IGF-ⅠmRNA和血液IGF-Ⅰ水平相关。Duclos（2005）通过遗传学和营养模型综合分析得出的数据表明，决定旁分泌的IGF-Ⅰ水平的肌肉IGF-ⅠmRNA丰度和出生后鸡的肌肉生长正相关。本试验结果发现，与对照组相比，抗生素组、溶菌酶组1和溶菌酶组2可将肝脏IGF-Ⅰ mRNA水 平 分别 提 高 18.8%（P ＜ 0.05）、12.5%（P ＞0.05）和 10.4%（P ＞ 0.05），抗生素组和 2个溶菌酶组胸肌IGF-ⅠmRNA水平有提高的趋势，但无显著差异（P ＞ 0.05），这与 Beccavin 等（2001）及Duclos（2005）的研究结果类似。Hathaway等（1996）给断奶猪饲喂抗生素ASP-250（四环素、磺胺甲嘧啶和青霉素的混合物）发现，血清IGF-Ⅰ浓度显著高于对照组（P＜0.001），血清IGF-Ⅰ浓度提高24.8%的同时猪平均日增重提高26%，血清IGF-Ⅰ的受体IGFBP-3含量增加59%，推测使用抗生素影响IGF-Ⅰ从而促进猪生长。本试验虽未检测抗生素对IGF-Ⅰ及其受体含量的影响，但结果发现抗生素较对照组可显著提高肉鸡肝脏IGF-ⅠmRNA水平（P＜0.05），与上述报道类似。

另有报道称肝脏IGF-Ⅰ基因受到生长激素（GH）、日粮能量及蛋白质浓度等因素调节（VandeHaar 等 ，1991；Emler 和 Schalch，1987；Roberts等，1986）。本试验结果证明，除上述因素外，抗生素类物质也可影响肝脏IGF-Ⅰ基因表达，这也可能是其促生长机制之一。但溶菌酶是直接导致IGF-Ⅰ基因表达的提高，还是通过其他途径间接导致IGF-Ⅰ基因表达改变从而影响动物生长后，具体作用机制还有待深入研究。

4 小结

日粮中添加150 mg/kg和300 mg/kg的溶菌酶可将42日龄肉鸡肝脏IGF-ⅠmRNA水平较对照组分别提高12.5%和10.4%，但与对照组及抗生素组比较差异不显著（P＞0.05）；其对胸肌IGF-ⅠmRNA水平也有提高趋势（P＞0.05）。

[1]马莉，谢秀兰，岳华.鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立[J].中国畜牧兽医，2007，34：2.

[2]中华人民共和国农业部.NY/T 33-2004，中华人民共和国农业行业标准——鸡饲养标准[S].2004-08-25.

[3]Beccavin C，Chevalier B，Cogburn1 L A，et al.Insulin-like growth factors and body growth in chickens divergently selected for high or low growth rate[J].Journal of Endocrinology，2001，168：297 ～306.

[4]Daughaday W H，Rotwein P.Insulin-like growth factorsⅠ andⅡ：peptide，messenger ribonucleic acid and gene structures，serum，and tissue concentrations[J].Endocr Rev，1989，10：68 ～91.

[5]Duclos M J.Insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA levels and chicken muscle growth[J].Journal of Physiology and Pharmacology，2005，56（3）：25 ～35.

[6]Emler C A，Schalch D S.Nutritionally-induced changes in hepatic insulinlike growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）gene expression in rats[J].Endocrinology，1987，120：832.

[7]Frank M T，Robert A P，John P M，et al.Francis.Insulin-like Growth Factor（IGF）-Ⅰ but Not IGF-Ⅱ Promotes Lean Growth and Feed Efficiency in Broiler Chickens[J].General and Comparative Endocrinology，1998，110：262～275.

[8]Hathaway M R，Dayton W R，White M E，et al.Serum insulin-like growth factorⅠ（IGF-Ⅰ）concentrations are increased in pigs fed antimicrobials[J].J Anim Sci，1996，74：1541 ～1547.

[9]Perrone C E，Fenwick-Smith D，Vandenburgh H H.Collagen and stretch modulate autocrine secretion of insulin-like growth factor-Ⅰand insulinlike growth factor binding proteins from differentiated skeletal muscle cells[J].J Biol Chem，1995，270：2099 ～2106.

[10]Roberts C T Jr，Brown A L，Graham D E，et al.Growth hormone regulates the abundance of insulin-like growth factor-ⅠmRNA in adult rat liver[J].J Biol Chem，1986，261：10025.

[11]Schmid C H，Steiner T H，Froesch E R.Preferential enhancement of myoblast differentiation by insulin-like growth factors（IGFⅠ and IGFⅡ）in primary cultures of chicken embryonic cells[J].FEBS Lett，1983，161：117 ～121.

[12]VandeHaar M J，Moats-Staats B M，Davenport M L，et al.Reduced serum concentrations of insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）in proteinrestricted rats are accompanied by reduced IGF-ⅠmRNA levels in liver and skeletal muscle[J].J Endocrinol，1991，130：305.

[13]Widmer U，Schmid C H，Zapf J，et al.Effects of insulin-like growth factors on chick embryo hepatocytes[J].Acta Endocrinol，1985，108：237 ～244.