豆粕抗营养因子及其生物改性的研究

内蒙古工业大学化工学院 高美云 张 通

农业部饲料生物技术重点实验室

中国农业科学院饲料研究所基因室 刘 宾 滕 达 田子罡 王建华＊

与棉籽粕、菜籽粕、花生粕相比，豆粕不仅蛋白质含量高（约44%），还具有氨基酸平衡（赖氨酸含量高达2%以上）、适口性好、消化率高（85%）等特点；与鱼粉、肉骨粉、血浆蛋白粉等动物源性蛋白质相比，豆粕具有供应充足、不易被病原菌污染或氧化腐败，安全系数高等特点。但是，豆粕中存在许多抗营养因子（如胰蛋白酶抑制剂、脲酶、抗原蛋白、皂甙等），这些抗营养因子对幼龄动物肠道结构具有较大的破坏作用，会引起腹泻等疾病。因此，利用物理、化学、生物学方法去除豆粕中的抗营养因子，有利于提高其营养价值。

1 豆粕抗营养因子

1.1 抗原蛋白 截至2009年5月19日国际免疫学联合会（IUIS）认定的大豆过敏原共34种，其中32种来自栽培大豆，2种来自野生型大豆（http://www.allergenoline.org/）。这些抗原蛋白的分子量范围为7.0～71 ku。在动物营养研究中，根据含量和致敏度，认为7S球蛋白组分中的Gly m Bd 60K、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K、11S 球蛋白是豆粕中主要致敏蛋白，这4种蛋白质都是大豆种子储藏蛋白（Ogawa等，2000）。

1.1.1 抗原蛋白特征 Gly m Bd 60K是β-伴球蛋白（β-conglycinin）的 α-亚基，能被 25%过敏患者血清识别（方旭前等，2006）。β-伴球蛋白占大豆蛋白质的30%，是高丰度蛋白质，也是最重要的豆粕致敏原。β-伴球蛋白的α亚基与α′亚基、α亚基与β亚基、α′亚基与β亚基间不变氨基酸残基的比例分别为90.4%、76.2%和75.5%，但识别60K的IgE抗体同β-伴球蛋白中的另两个亚基 α′和 β 并无交叉反应（Ogawa等，2000）。

Gly m Bd 30K蛋白几乎存在于所有大豆品种，尚未发现自然缺失该蛋白的品种（Yaklich等，1999）。Gly m Bd 30K在大豆中是一种低含量蛋白质组分，其含量小于大豆蛋白质总含量的1%（Eliot等，2003），但能引起65%大豆过敏患者发生过敏反应（Helm 等，2000；1998），是大豆中致敏性最强的储藏蛋白。Gly m Bd 30K与大豆种子34K种子空泡蛋白P34相同，故名P34，其功能尚不清楚，也未见关于Gly m Bd 30K的酶活性相关报道。30K至少有14个抗原表位。

Gly m Bd 28K是豆粕中存在的另一重要过敏原，含量低于30K蛋白，为低丰度蛋白。通过用大豆致敏患者血清作的免疫检测发现，Gly m Bd 28K与其C端23KD片段都具免疫原性（Ping等，2004）。Gly m Bd 28K是否被加工成两条单独肽链，以及这两条肽链是否像大豆球蛋白一样经疏水作用而结合仍不清楚（Mills等，2002）。根据都可与IgE抗体结合的特点，推测这两种肽链在体内会是结合的。

1.1.2 抗原蛋白的作用机制 幼龄动物肠道发育不成熟，采食含大豆日粮后，大部分抗原蛋白被降解为肽和氨基酸，小部分抗原蛋白会穿过小肠上皮细胞间隙或上皮细胞内的空隙完整地进入血液和淋巴，刺激肠道免疫组织，产生包括特异性抗原抗体反应和T淋巴细胞介导的迟发性过敏反应，前者刺激肥大细胞释放组胺，引起上皮细胞通透性增加和黏膜水肿，后者主要引起肠道形态变化。过敏反应将使幼龄动物血清中大豆抗原特异性抗体滴度升高，小肠绒毛萎缩，隐窝细胞增生（Li等，1990），同时导致消化吸收障碍、生长受阻以及过敏性腹泻。

1.2 胰蛋白酶抑制剂 大豆中胰蛋白酶抑制剂（TI）含量约为2%，是大豆主要抗营养因子之一，按其结构可分为2种，即Kunitz胰蛋白酶抑制剂（简称KTI）和Bouman-Birk胰蛋白酶抑制剂（简称BBI）。KTI含量约1.4%，主要抑制动物体内分泌的胰蛋白酶活性；BBI含量约0.6%，可同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。当动物采食含胰蛋白酶抑制剂的大豆饲料后，肠道中蛋白酶作用被抑制，阻碍动物对饲料蛋白质的消化吸收，还造成胰腺本身的补偿性反应，分泌过多胰腺酶，导致必需氨基酸的内源性损失；另外，还可引起肠胃中毒、胰腺肿大，消化吸收功能失调，抑制生长，尤其对幼龄动物影响大（Perez-Maldonado，2003）。

1.3 大豆凝血素 大豆凝血素是一种高亲和性的糖蛋白，在大豆中含量约3%，其在动物肠道中不易被蛋白酶水解，它通过与小肠壁上皮细胞表面特异性受体相结合，损坏小肠壁刷状缘黏膜结构，干扰消化酶分泌，抑制肠道对营养物质的消化吸收，降低蛋白质利用率，使动物生长受阻甚至停滞（Liener，2000）。 另外，凝血素还对肠壁、肠道细菌及免疫机能产生一定影响，引起肠腔糜烂，微绒毛变短萎缩，肠细胞退化，病变周围组织水肿和杯状细胞肥大增生等。Palacios等（2004）用除去凝集素和胰蛋白酶抑制因子的熟大豆饲喂雏鸡和幼猪，结果发现这两种抗营养因子对幼猪的影响大于雏鸡，因此大豆凝集素对动物生产性能的影响随动物年龄、物种等因素而异。

1.4 低聚糖 大豆中低聚糖含量为5%～6%，主要包括棉籽糖、水苏糖等，它具有营养和抗营养双重作用，一方面低聚糖又称为胃肠胀气因子，由于人或动物缺乏α-半乳糖苷酶不能水解棉籽糖与水苏糖，摄入的α-半乳糖苷不能被消化吸收，当它们进入大肠后，经细菌发酵，会产生CO2、H2及少量CH4，引起消化不良、腹胀、肠鸣、腹泻等现象，同时也降低了含α-半乳糖苷饲料的消化能值。另一方面它又是益生素，能被双歧杆菌等有益微生物特异性利用，促进有益菌增殖，有益菌的增殖产生代谢产物乳酸和短链脂肪酸，降低肠道pH值，从而抑制了病原菌生长，增强了动物的抗病性能（张树清等，2007；徐超斗等，2005）。

1.5 植酸 大豆中80%的磷以植酸态存在。植酸能和饲料中的矿物质元素，如铁、锌、锰等结合形成稳定的化合物，降低这些成分的消化利用率。植酸能与蛋白质结合，降低其溶解性，影响蛋白质的营养功能。植酸还可与淀粉酶、胰酶和胃蛋白酶结合，抑制其活性并可造成磷污染。Veum等（2002）总结了用低植酸豆粕和大麦的混合物饲喂猪，结果表明，磷和钙的吸收率分别可达到52.56%和78.59%。

1.6 其他 由于大豆蛋白酶抑制因子、凝集素、寡糖、植酸和抗原蛋白等对动物生长性能和生理健康影响较大，因此一直以来对上述几种大豆抗营养因子的研究较多。其他一些抗营养因子，如脂肪氧化酶、致甲状腺肿素、皂甙和脲酶等也有报道，但对其研究的深度还有待进一步加强。

2 消除豆粕中抗营养因子的方法

2.1 微生物发酵法 微生物发酵法是利用微生物产生的酶来降解豆粕中的抗营养因子，并累积有益的代谢产物。从工艺看，发酵可以从固态发酵和液态发酵，单菌种发酵和混合菌种发酵，以及一步发酵和多步发酵三方面分类。发酵工艺通常要考虑的因素有接种量、氮源、碳源、料水比、发酵时间、通气量等。如果选择合适的菌株，配合适当的发酵条件，可达到降解抗营养因子和大分子蛋白的目的。表1列出了不同菌株和发酵工艺对豆粕抗营养因子的影响。

表1 发酵对豆粕抗营养因子的影响

从营养和安全角度来看，发酵能够提高大豆食品的抗氧化功能。Rebeca等（2007）分别采用米曲霉、稻根霉菌和枯草芽孢杆菌发酵大豆48 h，维生素E的含量分别增加31%、30%和89%；总酚（TPC）含量分别增加19%、15%和31.9%。豆粕中异黄酮主要以异黄酮糖苷形式存在，即葡萄糖通过β-葡萄糖苷键与异黄酮苷元结合形成异黄酮苷，而只有游离的异黄酮苷元才具有生物学功能。大豆异黄酮苷元还具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性等性质。发酵豆粕异黄酮含量和抗菌性增强，发酵豆粕中提取、精制的异黄酮对细菌最低抑制浓度（MIC）为0.24%，而豆粕中提取精制的异黄酮对细菌最低抑制浓度为0.48%（杨国峰和周建新，2005）。Kuo等（2006）采用枯草芽孢杆菌发酵水解大豆异黄酮糖苷12 h，β-葡萄糖苷酶达到最大值3.3 U/mL，同时大豆苷元从 28.5 μmol/L 上升到 97.4 μmol/L， 染料木苷元从 54.0 μmol/L 上升到 120.3 μmol/L（表 2）。

混合菌种发酵处理生豆粕也有报道，莫重文和黄冈（2007）用米曲霉（A3.042）和啤酒酵母混合菌株固态发酵法生产发酵豆粕，利用霉菌生长时分泌的酶系降解豆粕中的多糖和蛋白质，使其变成利于消化的低分子糖类、肽类及氨基酸，再通过酵母菌的生长繁殖使这些物质变成菌体蛋白，不仅改善适口性，提高消化吸收率，还可提高发酵豆粕蛋白质含量。Lee等（2007）采用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和米曲霉进行分步发酵54 h，中性蛋白酶活可达到636 U/g，分别是米曲霉和枯草芽孢杆菌单菌发酵的1.7倍和2.2倍；氨基酸总含量分别是米曲霉和枯草芽孢杆菌单菌发酵的3.0倍和18.6倍。

表2 发酵对豆粕营养成分的影响

2.2 酶制剂处理法 酶解法是通过特定的酶来水解抗营养因子的一种新方法。Caine等（1998）用0.2 mg蛋白酶处理豆粕16 h即可将胰蛋白酶抑制因子的含量从10 mg/g降为0 mg/g；Mulimani等（1997）在豆粕中添加α-糖苷酶在50℃培育4 h，可使豆粕中的棉籽糖和水苏糖分别下降90.4%和91.9%。贾振宝（2002）采用Alcalase水解豆粕，当水解度达到25%时，β-伴球蛋白被彻底分解。酶解法具有产品安全性高、生产条件温和、水解易控制、可定位生产特定的大豆肽等优点，但其缺点是大豆蛋白质利用率不高（Kocher等，2002），仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶，酶解产肽率较低，且成本高。

2.3 化学处理法 化学钝化方法是近年来针对胰蛋白酶抑制剂广泛尝试的方法，其原理为通过改变TI分子结构，破坏二硫键，达到钝化TI活性的目的。张建云等（1999）用5%尿素+20%水处理生豆饼30 d，使胰蛋白酶抑制因子的失活率达78.55%。另外，通过化学处理在抗原蛋白Gly m Bd 30K上共轭一个多糖可以降低抗原免疫原性，共轭了一个多糖后的Gly m Bd 30K对人过敏血清及Gly m Bd 30K单克隆抗体的反应性完全消失（Arita等，2001）。该处理最可能的原理就是通过共轭反应掩盖了原有的一些抗原表位，并且共轭多糖后形成的高分子蛋白质性物质可在一定程度上提高蛋白质的热稳定性、乳化性和抗菌性。这对于制药、食品及饲料加工等均有重要的潜在价值。化学钝化应用的最大阻碍是化学物质残留，处理费用高和大量处理困难 （周春晖和黄惠华，2001）。

2.4 热处理法 热处理法对那些热不稳定抗营养因子，如蛋白酶抑制剂、大豆凝血素、致甲状腺肿素等有较好的抑制效果。Fasina等 （2003）在90～110℃膨化处理大豆20 min，脲酶失活73.9%～99.5%；胰蛋白酶抑制因子含量降为4.86～1.32 mg/g，失活89.6% ～97.2%；凝集素降为0.06～0.00 mg/g，失活95.6% ～100%。但大豆主要抗原蛋白具较高热稳定性，传统的加热处理不能使其有效灭活，因而广泛存在于大豆制品中（Li等，1991）。热处理过度还会破坏饲料氨基酸和维生素，导致蛋白质消化率下降，降低营养价值。另外，热处理在破坏大豆抗原蛋白天然分子表面抗原表位的同时，也会暴露出新的抗原表位。热处理法效率高、简单易行，无残留问题，成本也较低，但仅适用于对热不稳定的抗营养因子，且耗能大，控制不当还会破坏豆粕必需营养成分。

2.5 育种法 通过植物育种途径可培育低或无抗营养因子的植物品种，从根本上去除抗营养因子。韩粉霞等（2005）采用杂交技术和生化分子标记法筛选出无脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂这两种抗营养因子基因的功能性大豆。但抗营养因子多是植物防御类物质（Clarke和Wiseman，2000），降低其含量可能对植物抗病等不利，如增产、抗病能力降低，而且育种周期较长、成功率低，成本也高。并且，在不影响大豆种子结构和生理发育的情况下，完全去除所有抗原是不可能的。该方法是否会带来一些营养和功能上的负面影响，或者是否会表达出新的抗原成分也需进一步考证。

综上所述，微生物发酵法可有效分解和破坏豆粕中的抗营养因子，提高豆粕的营养价值。与目前普遍采用的物理、化学脱敏方法相比，微生物发酵技术是一种更为有效、经济的改善豆粕营养价值的手段，更符合健康养殖的要求。

3 小结

植物蛋白质原料中普遍存在植物过敏源和抗营养因子，使植物蛋白质的消化率和生物学效价远不及鱼粉等动物源性蛋白质；同时动物试验已证实植物过敏物质是造成幼龄动物（如断乳仔猪）腹泻、生长迟缓等营养性疾病的主要原因。近年来，随着市场需求增大和相关资源逐步枯竭，优质动物源性蛋白质不断涨价，已严重影响我国养殖业经济效益。因此去除植物蛋白质中抗营养因子，改善植物蛋白质品质，将其用于替代动物源性蛋白具有现实意义。

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