碳角属真菌Xylaria sp.NH1801中除草活性化合物研究

刘 芳，王月莹，张志刚，吴兆圆，张亚妮，方 伟

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉430064）

微生物是自然界的天然产物宝库，其代谢产物结构种类十分丰富，在已商业化的除草剂产品中，有很多母体结构来自微生物代谢产物。细胞松弛素是由聚酮合成酶和氨基酸合成酶共同作用形成的大环含氮杂环类的化合物，这类化合物结构多样，现已经分离得到数百个类似化合物，具有多种药理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等［1］。随着研究的不断深入，发现细胞松弛素类化合物具有植物毒性，可以抑制植物生长。球毛壳菌素类化合物如球毛壳菌素A、C、V、E、F、Fex、K和O等化合物具有抑制小麦胚芽生长［2］，抑制苜蓿种子发芽［3］，抑制水芹菜种子［4］和萝卜种子萌发［5］作用。另一类细胞松弛素类化合物细胞松弛素E对萝卜种子根生长抑制活性IC50达1.57 μmol/L，细胞松弛素Z16对小麦种子根生长抑制活性IC50达17.35 μmol/L，而对萝卜种子没有影响［6］。在筛选具有除草活性资源时，得到1株碳角菌属真菌Xylariasp.NH1801，其发酵提取物具有显著抑制植物种子萌发的作用，对其进行活性成分跟踪分离，得到1个细胞松弛素及其水解产物，并对2个化合物抑制稗草［Echinochloa crusgalli（L.）Beauv］和反枝苋（Amaranthus retroflexusL.）种子萌发作用进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振仪（TMS为内标，δ为mol/mL）（德国Bruker⁃BioSpin公司）；Waters 2695液质联用仪（美国Waters公司）；100~200目柱色谱填料柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）。化合物2，4-D（阿拉丁试剂有限公司）。试剂石油醚、乙酸乙酯、吐温-80、葡萄糖均为国药集团生产。培养所用马铃薯和大米均采购于市场。

1.1.2 试验材料发酵菌种从湖北省武汉市郊区土壤中分离纯化获得，通过形态鉴定和ITS序列比对，该菌种鉴定为Xylariasp.，命名为Xylariasp.NH1801，该菌株已于2020年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保存，保藏编号为CCTCC NO：M2020734。稗草和反枝苋种子均采购于市场。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH；大米培养基：大米80 g，水100 mL，放入500 mL培养瓶中，121℃灭菌后备用。

1.2.2 种子液的制备将斜面菌种Xylariasp.NH1801接种于茄形瓶中（PDA培养基），28℃恒温培养7 d，用含0.1%吐温-80的无菌水将孢子洗下，配制成浓度为1.0×107个孢子/mL的菌悬液，备用。

1.2.3 发酵培养按3%的接种量将菌悬液接入到大米培养基中（共接种5瓶培养基，大米用量400 g），28℃、静置培养8 d。

1.2.4 提取分离在发酵瓶中加入等体积的乙酸乙酯，振荡提取1 h，取上清液。回收乙酸乙酯溶剂得到乙酸乙酯提取物。加入少量甲醇溶解乙酸乙酯提取物，上硅胶柱（100~200目，青岛海洋化工）。依次用石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，3∶1，2∶1，1∶1）洗脱，收集石油醚∶乙酸乙酯2∶1洗脱部分，合并，回收溶剂，用甲醇溶解后，结晶，得到化合物1（200 mg）。

1.2.5 化合物1的水解将化合物1（50 mg）溶解于K2CO3溶液中，室温搅拌6 h，用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，水洗至中性，回收乙酸乙酯，重结晶，得到化合物2（40 mg）。

1.2.6 种子萌发抑制试验分别称取化合物1、化合物2和除草剂2，4-D，用甲醇溶解成1 mg/mL。然后依次用甲醇化合物稀释成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL。将各个浓度的试药加入12孔板中，每孔200 μL，每个浓度3个复孔，空白对照加入相同剂量的纯甲醇，挥干甲醇备用。将种子用流水冲洗4 h后，用高锰酸钾溶液消毒15 min，无菌水冲洗干净，晾干，每孔加入4粒种子，然后加入无菌水200 μL，28℃恒温培养箱中放置48 h后观察结果。用游标卡尺测量每粒种子发芽后的茎与根的长度，按以下公式计算药物对种子萌发的抑制率。

抑制率=（空白长度-样品长度）×100%/空白长度

2 结果与分析

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1：白色结晶，ESI（M+）：524；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.71，176.72，171.92，138.18，132.99，132.29，131.04，129.66，127.92，77.91，73.96，64.07，60.99，58.83，56.49，55.98，54.33，51.16，46.00，45.75，42.76，38.85，37.75，22.18，20.38，19.56，19.46，12.36。结合文献报道［7］数据鉴定化合物为19，20-环氧-细胞松弛素Q（19，20-epoxy-cytochalasin Q）（图1）。

化合物2：白色结晶，ESI（M+）：482；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.95，178.49，138.21，132.55，132.43，131.14，129.67，128.05，78.11，73.18，64.65，60.97，59.23，57.38，56.21，55.65，52.29，45.53，44.75，42.98，38.84，37.95，22.35，19.79，19.45，12.62。结合文献报道数据［7］鉴定化合物为21-去乙酰基-19，20-环氧-细胞松弛素Q（21-deacetyl-19，20-epoxycytochalasin Q）（图1）。

图1 化合物1和化合物2的结构式

2.2 化合物抑制稗草种子萌发效果

化合物抑制稗草种子萌发的试验结果见表1。由表1可知，化合物1和化合物2均具有显著抑制稗草种子萌发的活性，在最高浓度为200 μg/mL时，根长抑制率分别为83.3%和80.7%，茎长抑制率分别为80.4%和79.4%，对茎长抑制率与阳性对照除草剂2，4-D（78.8%）相当。化合物1和化合物2对稗草种子根的生长抑制作用强于对茎的生长抑制，在低浓度50 μg/mL时，化合物1和化合物2对根长抑制率分别为65.7%和60.7%，强于对茎长的抑制（分别为37.5%和34.5%），但是化合物1和化合物2对稗草根长的抑制均弱于除草剂2，4-D。

表1 化合物对稗草种子萌发的抑制率 （单位：%）

2.3 化合物抑制反枝苋种子萌发效果

化合物抑制反枝苋种子萌发试验结果见表2。化合物1和化合物2均具有明显抑制反枝苋种子萌发的活性，在200 μg/mL浓度时，化合物1和化合物2可以完全抑制种子萌发，抑制率达100%，强于对照药物除草剂2，4-D（抑制率87.1%）。在低浓度50 μg/mL时，化合物1和化合物2也具有显著的抑制活性，对种子萌发的抑制率分别为77.2%和75.4%，与对照药物活性相当（抑制率为79.8%）。但是在更低浓度时，化合物1和化合物2的活性弱于阳性对照药物2，4-D。

表2 化合物对反枝苋种子萌发的抑制率（单位：%）

3 讨论

随着除草剂的大量长期应用，不仅给环境带来巨大的压力，同时由于杂草的不断生存进化，抗性杂草种类不断增多，抗性不断增强，不断研发新型除草剂显得仍然十分迫切。细胞松弛素是由微生物代谢产生的一类杂环化合物，其结构变化多样，这也导致其活性的不同。球毛壳菌素类显示对萝卜种子萌发具有抑制作用，化合物结构中17位和21位对其活性较为关键［5］，化合物1和化合物2活性结果表明这一类化合物21位的乙酰化对活性没有显著影响。球毛壳菌素类化合物均没有显示剂量依赖作用，这一点与本试验中2，4-D针对反枝苋效果类似［5］。另一类细胞松弛素类化合物细胞松弛素K和细胞松弛素E可以显著抑制萝卜种子萌发，并对根生长的抑制作用要强于茎，这与本研究中化合物对稗草的作用类似；在较低浓度时，细胞松弛素Z16和细胞松弛素K对萝卜种子有较弱的促进生长作用［6］。细胞松弛素类化合物具有广泛的除草活性，且结构与活性可变性较强，有望成为除草剂的先导化合物或者微生物类的生物除草剂。