分子荧光法对水中氨氮含量的测定

余渤 许星星 毛博

摘要：采用分子荧光法对水中氨氮含量进行了测定，在硼酸缓冲液作用下，邻苯二甲醛（OPA）与氨氮反应，生成具有荧光性的物质，在一定的pH、反应温度和静置时间条件下，以362 nm为激发波长，在425 nm发射波长处测定荧光物质的荧光强度，探究了四硼酸钠、亚硫酸钠和OPA混合溶液配比、反应温度、静置时间对衍生物荧光值的影响。结果表明，在一定浓度范围内，衍生物的量与荧光强度有良好的线性关系，该方法灵敏度高，适用于氨氮浓度较低水样的测定，对于高浓度水样也可进行简单稀释后测定。

关键词：氨氮;分子荧光;邻苯二甲醛（OPA）

中图分类号：O657.3        文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）10-0131-003

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.031            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Ammonia nitrogen in water was determined by molecular fluorescence method. Fluorescent substances were formed based on the reaction of phthalaldehyde （OPA） with ammonia nitrogen in boric acid buffer. Under certain pH value， suitable temperature and static time， fluorescence of fluorescent substances was were determined at 425 nm with 362 nm as excitation wavelength. The effects of the ratio of sodium tetraborate， sodium sulfite and OPA， temperature and time on the fluorescence value of the derivatives were investigated. The results showed that there was a good linear relationship between the amount of derivatives and the fluorescence intensity in a certain concentration range. This method has high sensitivity and is suitable for the determination of ammonia nitrogen in low concentration water samples. It could also be used for the determination of high concentration water samples after simple dilution.

Key words： ammonia nitrogen; molecular fluorescence; phthalaldehyde（OPA）

隨着全球经济的快速发展以及城市化进程的不断加快，人们用水的总量持续增长，废水排放总量也随之升高，废水中化学物质氨氮的污染早已成为国内外普遍关注的焦点[1-4]。氨氮是水中的一种营养素，可导致水体富营养化，水体生物无法完全转化吸收，而且氨氮的分解需要氧气的参与，必然会导致水中氧含量降低，造成缺氧的情况，继而威胁水生生物的生存[5-7]。

随着科学技术的发展，氨氮分析方法层出不穷，主要有蒸馏-中和滴定法、分光光度法、离子色谱法、荧光分析法等[8-10]。蒸馏-中和滴定法属于传统的化学分析方法，这种手工常量分析方法逐渐被自动化程度较高的仪器分析所代替。离子色谱法分析速度快，样品消耗少，但受离子强度的限制[11]，目前研究较多的是荧光分析法和分光光度法。荧光分析法检测时，荧光与入射光呈90°，即在检测荧光的发射时背景是黑暗的，而分光光度法检测透过或吸收时有入射光的背景干扰，因此分子荧光分析法的灵敏度通常比分光光度法高出2～4个数量级。荧光分析法相较于其他分析方法具有设备简单、分析灵敏度高、选择性强等优势，能对传统方法不能检测的痕量氨氮进行测量，对于常量组分也可进行简单稀释后定量测定。因此，本试验采用分子荧光分析法测定水中氨氮含量，探讨影响荧光测定的各个因素的最佳条件，旨在为水质中氨氮高灵敏度监测提供一定的依据。

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

F-2700型荧光分光光度计（配1 cm石英测定池，日本日立集团），优级纯氯化铵（NH4Cl，GR，天津市大茂化学试剂厂），分析纯亚硫酸钠（Na2SO3，AR，天津市凯通化学试剂有限公司），四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O， AR，天津凯通化学试剂有限公司），邻苯二甲醛（C8H6O2，AR，天津市大茂化学试剂厂），测试水样来自武汉东湖学院莲藕池。

1.2  方法

1.2.1 溶液的配制    准确称取0.267 5 g经100 ℃干燥过的优级纯氯化铵溶于水中，移入500 mL棕色容量瓶中，用水稀释混匀至标线，即为氨氮标准储备液（10 mmol/L）。准确吸取1.0 mL氨氮标准储备液转移到100 mL棕色容量瓶中加水稀释至刻度，即为氨氮标准使用液（0.10 mmol/L）。将0.126 g Na2SO3溶于水中并转移定容至100 mL棕色容量瓶中，得到亚硫酸钠溶液（10 mmol/L）。准确称取1.000 0 g四硼酸钠溶于水，转移至100 mL容量瓶中， 加水稀释至刻度即可得四硼酸钠溶液（10 g/L）。将0.335 g邻苯二甲醛溶解在水中并转移到100 mL棕色容量瓶中，并将体积调节至刻度可得OPA溶液（25 mmol/L），试验用水均为无氨水。四硼酸钠、亚硫酸钠和OPA溶液以1∶1∶1混合成混合试剂备用。

1.2.2 荧光强度的测定    准确移取一定量的氨氮标准溶液或水样于25 mL棕色容量瓶中，加入一定量的混合试剂，调节pH，用无氨水稀释至刻度，在适当温度下静置一定时间后，在最佳激发波长和最佳发射波长下用分子荧光光谱仪测试其荧光强度。

2  结果与分析

2.1最佳波长的选择

设定激发光波长范围为300～420 nm，发射光波长范围为360～500 nm，扫描氨氮标准溶液的激发光谱和发射光谱，扫描结果如图1所示。由图1a可知，最大激发波长为362 nm，由图1b可知，最大发射波长是425 nm。

2.2  混合剂最佳配比

荧光光度法检测出氨氮含量原理是在水样中加入邻苯二甲醛后，氨氮与邻苯二甲醛在碱性条件下发生配位反应，生成的异吲哚配位衍生物具有荧光特性，可以被分子荧光仪检测到荧光信号。其主要反应試剂邻苯二甲醛（OPA）溶液作为显色剂，四硼酸钠溶液为缓冲剂提供碱性环境，亚硫酸钠溶液为增稳增敏剂。分别研究了这3种试剂的使用量对荧光值的影响，绘制荧光强度关系曲线，如图2所示。

由图2可知，四硼酸钠加入量为1.0 mL时，pH为10，荧光强度达到最高并且趋于稳定，加入1.0 mL OPA时，荧光强度达到最高，加入1.0 mL亚硫酸钠溶液时， 荧光强度达到最高。结果表明， 总量为3 mL的混合试剂最佳成分比例为四硼酸钠（10 g/L）、亚硫酸钠（10 mmol/L）和OPA（25 mmol/L）分别1 mL，此时溶液pH为10。

2.3  荧光强度与反应温度、静置时间的关系

取4个25 mL的容量瓶，分别加入2.0 mL氨氮标准使用液，用无氨水定容，调节pH至10，分别以反应温度、静置时间为因变量，检测其荧光强度，检测结果如图3、图4所示。结果表明，在30 ℃下静置30.0 min时，其荧光强度最大。

2.4  标准曲线的绘制

取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL（2.00、 4.00、 6.00、8.00、10.00 μmol/L）氨氮标准溶液于容量瓶中，用无氨水定容至25.00 mL，加入3.0 mL混合试剂，混匀静置30 min。在激发波长为362 nm和发射波长425 nm下检测标准溶液的荧光值，绘制标准工作曲线，结果如图5所示。结果表明，衍生物浓度与荧光强度具有良好的线性关系，回归方程为y=15.56x+71.16，相关系数为0.999 6。

2.5  加标回收率测定

对稀释5倍的水样进行测定，对每个平行水样测定3次。同时，为检验准确程度，对平行水样进行加标回收试验，加标量为8 μmol/L，水样测定和加标回收率结果如表1所示。根据标准曲线方程，将水样的荧光强度代入线性回归方程，即可得待测水样中氨氮的浓度，分别为6.67、6.90和7.06 μmol/L，计算出水样中氨氮浓度分别为33.5、34.7、35.5μmol/L，平均浓度为为34.6 μmol/L。待测水样加标回收率为93.5%～98.3%，说明该分析方法准确可靠，可用于水中氨氮含量的测定。

3  结论

通过对含氨氮溶液荧光光谱的分析，确立了氨氮的最大激发波长和最大发射波长分别为362和425 nm。在最大激发波长和最大发射波长条件下，对标准溶液及待测样品进行了分析，pH、OPA溶液用量、亚硫酸钠溶液用量、静置时间、反应温度对检测结果都有一定影响。结果表明， 在30 ℃时pH10、3 mL混合试剂、静置30 min条件下测定水中物质的荧光强度力最佳条件，此条件下荧光物质的浓度与荧光强度具有良好的线性关系，相关系数0.999 6。

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