乳酸菌分离鉴定及其条斑紫菜乳酸局混合发酵理化因子的变化

王雪宁 朱新迎 成群

摘要：对泡菜老坛水中的乳酸菌进行分离鉴定，获得3株乳酸菌，确定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。以条斑紫菜（Porphyra yezoensis）为原料，以4种不同配比的上述乳酸菌对条斑紫菜进行直投式发酵，探讨发酵过程中发酵液部分理化因子的变化规律。结果显示，4种发酵液的pH下降趋势相似，从开始的4.51下降到2.90;1∶1∶2（体积比）混合乳酸菌发酵液的产酸能力最强，发酵终点总酸含量为13.75 g/L，为发酵开始的6倍;1∶1∶2混合乳酸菌发酵液的总糖含量由开始的29.95 g/L下降为发酵终点的18.97 g/L;1∶1∶2混合乳酸菌发酵液亚硝酸盐含量的峰值最小，为3.75 mg/kg;1∶1∶1混合乳酸菌发酵液氨基酸含量较高，最大值为58.16 μmol/mL;蛋白质含量下降幅度最大的是1∶1∶3混合乳酸菌发酵液。

关键词：乳酸菌;分离鉴定;条斑紫菜（Porphyra yezoensis）;发酵;理化因子

中图分类号：S188         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）10-0139-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.033           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Three strains of lactobacillus were isolated and identified from fermented liquid of pickle after isolation and identification. They were identified as Lactobacillus brevis， Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei. Then these lactic acid bacteria were used to directly ferment Pyropia yezoensis with four different ratios， and some physical and chemical changes in the fermentation process was discussed. The results showed that all four kind of mixed lactobacillus fermentation broth had similar pH decline trends， from 4.51 to 2.90; 1∶1∶2 （V∶V∶V） mixed lactobacillus fermentation broth had the strongest acid production capacity， and at the end point of fermentation， the total acid content was 13.75 g/L， which was 6 times of the beginning; the total sugar content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was from the initial 29.95 g/L to 18.97 g/L at the fermentation end point; the minimum peak of nitrite content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was 3.75 mg/kg; the higher amino acid content occurred in 1∶1∶1 mixed lactobacillus fermentation broth， with the maximum value of 58.16 μmol/mL; the 1∶1∶3 mixed lactobacillus fermentation broth had the largest decrease of protein content.

Key words： lactobacillus; isolation and identification; Porphyra yezoensis; fermentation; physical and chemical factors

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）属红藻纲红毛草科，是最常见的一种食用海藻，富含蛋白质及氨基酸，还含有钙、铁、磷等微量元素，具有特殊的挥发性风味物质，既可食用也可药用[1-3]。因为紫菜具有很好的营养价值，所以常在食品加工业中作为一类重要的原材料。紫菜产业是国内具有经济价值的海产养殖业之一，其中连云港市作为全国紫菜的两大生产基地之一，产量占全国的60%以上，养殖业迅速扩大，紫菜产量剧增，但紫菜的深加工产品比较单一，没有达到很好的经济效益[4]。目前，对于紫菜的研究方向大多集中在紫菜酱及紫菜功能成分的提取等方面[5，6]。

乳酸菌指一类具有兼性厌氧的、不产芽孢的，可利用糖类化合物进行反应，生成乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌具有丰富的生物多样性，被广泛应用在食品行业、医药保健行业等领域。泡菜是指隔绝空气后在低浓度盐水腌制条件下，其本身带有微生物或人工添加乳酸菌作为发酵剂，发酵蔬菜产生大量乳酸的一类传统蔬菜发酵类食品。发酵过程产生的乳酸等风味物质，除了改善食品的风味、提高蔬菜营养价值外，还可以抑制其他腐败菌的生长代谢活动[7]。乳酸菌还有助于改善人体肠道菌群，提高消化能力，减轻便秘，降低胆固醇[8]。

本研究从泡菜老坛水中分离乳酸菌， 利用16S rRNA分子生物学检测的方法对其进行初步鉴定。以分离鉴定的乳酸菌形成不同配比，将其作为发酵剂，对紫菜进行直投式发酵，探讨不同配比乳酸菌发酵剂对条斑紫菜混合发酵过程中理化因子的变化，以期为紫菜加工业提供理论依据并提高紫菜相关产业的经济效益。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

泡菜老坛水、条斑紫菜：市场购买;总氨基酸（A026-1-1）、总蛋白质（A045-2）、亚硝酸盐（A038）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;其他化学试剂均为分析纯。

改良乳酸菌培养基：酵母膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，葡萄糖10 g，KH2PO4  2 g，番茄汁100 mL，吐温80 0.5 mL，去离子水900 mL，调pH 7.0（固体培养基添加琼脂10 g/L），121 ℃灭菌15 min。MRS培养基：葡萄糖20 g ，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸三铵5 g，磷酸氢二钾2 g，三水乙酸钠5 g，吐温80 1 mL（琼脂15～17 g），去离子水1 000 mL。

两种培养基调pH为 6.5，0.07 MPa（115 ℃）灭菌20 min备用。

1.2  仪器与设备

ReadMax 1900 Plus光吸收型全波长酶标仪（上海闪谱科技有限公司）;T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;SevenEasy实验室pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）]。

1.3  方法

1.3.1  乳酸菌分离鉴定  取 100 μL老坛水和900 μL无菌水到1.5 mL离心管中振荡混匀作为10-1稀释液，以10倍稀释法对其进行梯度稀释到10-6。吸取100 μL 10-4、10-5和10-6稀释液涂布至灭菌的改良固体培养基上，每个梯度3个平板，在37 ℃条件下培养48 h，然后挑取具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行平板划线分离纯化。将分离纯化后的单菌落接种到5 mL的MRS液体培养基中，37 ℃条件下振荡培养48 h。收集菌液送上海派森诺生物科技公司进行菌种鉴定。

1.3.2  条斑紫菜乳酸菌混合发酵  选取经鉴定后的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）进行不同比例的紫菜乳酸菌混合发酵，设计的比例为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3（OD550 nm调成一致条件下的体积比）以及干酪乳杆菌单菌发酵。准备12个玻璃发酵瓶，每个发酵瓶中称取10 g左右的干紫菜，无菌水200 mL，食盐添加量1 g，葡萄糖6 g，置于高压灭菌锅（105 ℃、20 min）灭菌后，在超净台中完成菌液的接种，菌种接种量为5%，密封后放入25 ℃生化培养箱中发酵，设置3个平行。每天对紫菜发酵液进行理化指标的检测，连续7 d，取样需无菌操作。

1.3.3  理化指标检测  pH测定用pH计;总酸的检测采用GB/T 12456―2008食品总酸检测方法[9];发酵液的亚硝酸盐、氨基酸、蛋白质含量的检测均按试剂盒的说明书操作;总糖含量的测定采用蒽酮比色法[10]。

2  结果与分析

2.1  乳酸菌分离鉴定

按“1.3.1”的方法获得3株乳酸菌，命名为HYR-1、HYR-4、HYR-9，经初步鉴定HYR-1为短乳杆菌、HYR-4為植物乳杆菌、HYR-9为干酪乳杆菌。图1显示的是3株菌16S rRNA经序列比对后采用MEGA6软件邻接法构建的系统进化树。

2.2  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液pH的变化

条斑紫菜乳酸菌混合发酵液pH的变化与发酵时间的关系如图2所示，发酵液的起始pH均在4.50左右，随着发酵时间的延长，乳酸菌混合发酵过程中pH整体呈下降趋势，在发酵1～2 d，pH下降速度很快，之后速度减缓，在发酵至5 d时，4种不同配比发酵液pH基本稳定且维持在2.90～3.05，不同配比的条斑紫菜乳酸菌混合发酵液在pH的变化上没有明显区别，表明乳酸菌发酵紫菜在发酵5 d时就已经达到发酵终点，大大缩短了发酵周期。这与成群等[11]研究乳酸菌制剂发酵泡菜过程中pH的变化趋势一致。

2.3  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液总酸含量的变化

由图3可知，4种不同比例乳酸菌混合发酵条斑紫菜过程中总酸含量的整体变化趋势相似，紫菜发酵过程中发酵液的总酸含量逐渐增加。发酵2 d总酸含量增长速度最快，之后增长速度减缓，到发酵5 d时总酸含量变化趋于平缓，从发酵开始总酸含量为2.30～3.52 g/L，到发酵终点总酸含量为12.96～13.75 g/L，1∶1∶2条斑紫菜乳酸菌混合发酵液产酸能力最强，发酵7 d总酸含量为13.75 g/L，为发酵开始时的6倍。单菌发酵开始总酸含量最高，到达发酵终点总酸含量反而最低，含量为12.96 g/L。表明乳酸菌混合发酵比单菌发酵的产酸能力略强。

2.4  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液总糖含量的变化

利用蒽酮比色法测得总糖标准曲线方程为y=6.379 1x+0.005 8，通过该方程计算条斑紫菜乳酸菌混合发酵液中的总糖含量。如图4所示，4种不同配比条斑紫菜乳酸菌混合发酵液的总糖含量逐渐降低，在发酵2 d时，总糖含量的降低速度最快，主要由于此时各类乳酸菌生长繁殖需要大量的碳源，因此利用发酵液中的糖分（主要为单糖和少量多糖）产生大量的乳酸及其他代谢产物。其中，1∶1∶2条斑紫菜乳酸菌混合发酵液的总糖含量由最开始的0.417 3 g/L到发酵终点0.284 0 g/L，发酵过程中消耗可溶性总糖量最大，利用率达到32.94%。1∶1∶1混合乳酸菌发酵过程中总糖含量在5 d时有升高的迹象，有可能是此时乳酸菌生长速度减缓，条斑紫菜中部分多糖类物质被分解到发酵液中的速度大于乳酸菌消耗可溶性总糖的速度[12]。从图4中还可以发现，单菌发酵分解可溶性糖类的能力比混合乳酸菌发酵能力弱。

2.5  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液亚硝酸盐含量的变化

条斑紫菜乳酸菌混合发酵液的亚硝酸盐含量与发酵时间的关系见图5。在发酵初期，4种发酵液中的亚硝酸盐含量的变化趋势均为先增加达到峰值之后再降低。4种发酵液的亚硝酸盐含量峰值均在2 d时出现，之后逐渐下降，最后在6～7 d时趋于平稳，且亚硝酸盐的含量均低于国家限量标准（20 mg/kg）。亚硝酸盐含量到达峰值后下降是由于各类乳酸菌大量繁殖后，产生大量乳酸等代谢产物，亚硝酸盐在酸性条件下不稳定，逐渐分解。同时，由于发酵过程中的氧气消耗殆尽，硝酸盐转化为亚硝酸盐的能力也逐渐降低。3种混合发酵液亚硝酸盐含量的峰值分别为3.91、3.75、3.84 mg/kg，而单菌发酵液的峰值为4.43 mg/kg，这可能由于单菌发酵产生的乳酸含量低于混合发酵的产酸量，酸解亚硝酸的能力也相对弱一些。1∶1∶2、1∶1∶3混合发酵液和单菌发酵液在发酵终点时亚硝酸盐含量降至最低， 约为0.25 mg/kg，而1∶1∶1混合发酵液在6 d时亚硝酸盐含量有略微升高趋势，最终为0.86 mg/kg，原因可能是在频繁取样过程中带入氧气或杂菌导致[13]。

2.6  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液总氨基酸含量的变化

条斑紫菜乳酸菌混合发酵液总氨基酸含量与发酵时间的关系见图6。4种不同配比乳酸菌发酵的發酵液中的氨基酸含量都是先增加后降低。发酵前期由于条斑紫菜中的蛋白质在乳酸菌的作用下，通过各种代谢途径降解为小分子肽和游离的氨基酸，以及条斑紫菜本身的呈味氨基酸不断溶入发酵液中，使得发酵液中的氨基酸含量呈快速增加状态。发酵后期，由于部分氨基酸被乳酸菌利用导致氨基酸含量下降，随着乳酸菌的代谢活动减慢，氨基酸含量也趋于稳定。1∶1∶3混合发酵液在发酵3 d时达到最大值，其他3种发酵液均在发酵2 d就达到最大值。其中，1∶1∶1混合发酵液发酵过程中氨基酸含量较高，最大值为58.16 μmol/mL，其他发酵液均在51.00 μmol/mL左右。这可能是由于1∶1∶1混合发酵液中短乳杆菌生长较好，对氨基酸含量的升高起积极作用，这与宋佳锟等[14]的试验结论相似。

2.7  条斑紫菜乳酸菌混合发酵液总蛋白质含量的变化

由图7可知，随着发酵时间的增加，发酵液中蛋白质含量先呈快速上升趋势，到达最大值后呈缓慢下降趋势，到发酵后期趋于平稳。在发酵2 d时发酵液中蛋白质含量达到最大值，此时单菌发酵的蛋白质含量最低，为2.42g /L，1∶1∶3混合发酵液中蛋白质含量最高，为4.32g /L，是单菌发酵的1.79倍。在发酵初期，在乳酸菌的发酵作用中，条斑紫菜中的蛋白质被不断释放到发酵液中，使得发酵液中的蛋白质含量快速增长，由于乳酸菌生长代谢利用发酵液中的蛋白质分解为氨基酸，使得发酵液中的蛋白质含量逐渐下降[15]。随着代谢活动减缓，发酵时间的延长，发酵液中蛋白质的含量也趋于平稳， 其中3种乳酸菌混合发酵到达终点时蛋白质含量在2.29～2.50g /L，而单菌发酵中蛋白质的含量为1.87 /L。从图7中可发现，蛋白质含量下降幅度最小的是单菌发酵，下降幅度最大的是1∶1∶3混合发酵液，说明复合菌利用蛋白质的能力比单菌发酵利用蛋白质的能力强。

3   结论

本试验利用16S rRNA序列比对法对老坛水中的乳酸菌进行分离鉴定，得到3株菌，初步确定为短乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌。以分离鉴定的乳酸菌形成不同配比，将其作为发酵剂对条斑紫菜进行直投式发酵，比例分别为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3及单菌。通过对4种不同乳酸菌发酵制剂发酵条斑紫菜过程中理化因子的变化规律进行研究，探索出单菌发酵和复合发酵对条斑紫菜发酵的影响。

对4种发酵液中的pH进行检测，结果发现4种发酵液的pH整体下降趋势相似，发酵2 d由于乳酸菌处于对数生长期，生长代谢最旺盛，发酵液pH迅速下降，到发酵5 d时呈平稳状态，4种发酵液的pH均从发酵前的4.50左右下降到2.90左右，这与于新颖等[12]测量的泡菜卤中pH的变化趋势相似。对总酸的检测中发现，总酸含量在发酵前3 d增加速度最快，并在发酵5 d后逐渐趋于平稳，从发酵开始的总酸含量为2.30～3.52 g/L，到发酵后期总酸含量为13.00～13.75 g/L，对比发现3种复合菌发酵比单菌发酵的产酸能力略强[16]。4种不同比例乳酸菌发酵条斑紫菜发酵液的总糖含量逐渐降低，其中1∶1∶2乳酸菌混合发酵的总糖含量由最开始的29.95 g/L下降到发酵终点的18.97 g/L，发酵过程中消耗可溶性总糖量最大。单菌发酵分解可溶性糖类的能力比乳酸菌混合发酵分解糖类的能力弱。在发酵初期，4种发酵液中亚硝酸盐的含量的变化趋势均为先增加达到峰值之后再降低[17-20]。4种发酵液发酵过程中亚硝酸盐峰值出现时间相同，但峰值大小不同，其中1∶1∶2混合发酵液的峰值最低，为3.75 mg/kg;单菌发酵的峰值最高，为4.43 mg/kg。发酵过程中发酵液的总氨基酸含量都是先增加后降低，其中1∶1∶1混合发酵液发酵过程中的总氨基酸含量较高，最大值为58.16 μmol/mL，其他处理均在51.00 μmol/mL左右。发酵液中的总蛋白质含量先呈快速上升趋势，发酵2 d达到最大值后呈缓慢下降趋势，到发酵5 d趋于平稳，其中总蛋白质含量下降幅度相对较小的是单菌发酵液，下降幅度相对较大的是1∶1∶3混合发酵液，说明混合发酵利用蛋白质的能力比单菌发酵利用蛋白质的能力强。

对从老坛水中分离并鉴定的纯种乳酸菌进行发酵试验，可以大大缩短条斑紫菜的发酵周期，发酵5 d进入平稳期，这是由于接种2 d后的乳酸菌处于对数增长期，繁殖能力旺盛，产酸能力强，产亚硝酸盐含量低，利用蛋白质和氨基酸能力强，这与赵文红等[21]的研究结果一致。4种乳酸菌发酵条斑紫菜的过程中，混合乳酸菌发酵比单菌发酵具有优势，其中1∶1∶2混合发酵液发酵效果最好。但由于条斑紫菜前期经过杀菌处理，排除了其他微生物的协同作用，所以风味方面还需要进一步研究。