铁皮石斛指纹图谱及生物活性成分研究进展

郭磊　肖坤敏　徐阳　谭大聪　王军民　华燕

摘要：铁皮石斛（Dendrobium officinal Kimura et Migo）兼具药用价值，不仅含有人体必需氨基酸，还含有多糖、黄酮类、生物碱等活性成分，具有降血压、降血糖、抗肿瘤等功效。但石斛属植物来源众多、成分差异较大，给铁皮石斛的鉴别带来困难，利用指纹图谱技术标记特征物质可以对其鉴别及品质评价提供一定的理论依据。另外，国内外学者已从铁皮石斛中分离鉴定出多糖、黄酮类、生物碱等多种生物活性成分，证实了这些成分的药效并推断其生理作用机制。从多角度总结了近几年铁皮石斛指纹图谱、生物活性成分及作用机制的研究进展情况，以期为铁皮石斛的鉴定及药物开发研究提供一定的科学依据。

关键词：铁皮石斛;指纹图谱;活性成分;功能;作用机制

中图分类号：Q-1;Q945         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）05-0005-05

Abstract： Dendrobium officinal Kimura et Migo has both high edible and medicinal value， which not only contains essential amino acids for human body， but also contains polysaccharides， flavonoids， alkaloids and other bioactive components， these ingredients can reduce blood pressure， blood sugar， anti-tumor and so on. However， it is difficult to identify Dendrobium officinal Kimura et Migo，because of its geographical origin and complex chemical components， use fingerprint technology could provide some theoretical basis to identify and evaluate Dendrobium officinal Kimura et Migo. In addition， domestic and foreign scholars had been isolated and identified polysaccharides， flavonoids， alkaloids and other bioactive components， the effect of these bioactive components was confirmed and their physiological mechanism was deduced. The relevant research on bioactive components and its function mechanism of Dendrobium officinal Kimura et Migo in recent years were summarized，in order to provide some scientific basis for identifying and drug developing of Dendrobium officinal Kimura et Migo.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo; fingerprint; bioactive components; function; function mechanism

鐵皮石斛（Dendrobium officinal Kimura et Migo）系兰科石斛属多年生草本植物，因表皮呈铁绿色而得名，属国家二级保护植物[1，2]。铁皮石斛居“中华九大仙草”之首，富含多糖、生物碱及倍半萜类化合物等有效成分，具有抗肿瘤、增强免疫力、降低血糖等作用[3-6]。自20世纪70年代，关于铁皮石斛茎、叶营养成分分析和药理药效研究就有了报道[7，8]，廖鲜艳等[9]分析发现秋季铁皮石斛茎中水分（863.10 mg/g）、多糖（289.90 mg/g）、铁（71.10 mg/kg）和硒（1.07 mg/kg）含量较春季高;叶中多糖（162.30 mg/g）含量比茎低，但有较高的可溶性蛋白质（4.20 mg/g）、总蛋白质（67.03 mg/g）、粗纤维（204.60 mg/g）和脂肪（14.70 mg/g）、天冬氨酸（13.60 mg/g）和谷氨酸（13.80 mg/g）等。纪照红等[10]对新疆产的不同种植年限铁皮石斛的营养成分分析后发现，铁皮石斛粗蛋白质、生物碱含量在1.92%～3.81%和0.022 5%～0.029 7%，且随着生理年龄的增加而显著增加。1年、2年、3年生铁皮石斛中总氨基酸含量分别为27.51、31.71、36.83 mg/g;必需氨基酸和非必需氨基酸的比值均在60%以上。张本厚等[11]比较3种铁皮石斛组培体和人工栽培铁皮石斛的营养成分，发现原球茎的多糖和总生物碱含量低于人工栽培铁皮石斛，但其多糖、总生物碱和总蛋白含量均高于2种组培苗。

铁皮石斛营养物质丰富，药用价值很高，但产地、生长环境和栽培管理模式等因素会造成化学成分和药用价值的差异，其伪品的鉴定也非常困难，指纹图谱技术在铁皮石斛的鉴定及药物质量评价中的应用越来越广泛。构建特征物质指纹图谱已经是鉴别及评价铁皮石斛品质的重要依据，而生物活性成分如多糖、黄酮类及生物碱类的结构及功能研究也为其新药开发提供了重要的理论支撑和科学依据。

1  铁皮石斛指纹图谱

指纹图谱是一种综合、宏观、可量化的鉴别手段，已公认为天然药物质量及产地鉴别的最有效手段[12]，在铁皮石斛鉴别及食品、保健品加工领域有着广泛的应用。高效液相色谱（HPLC）指纹图谱是铁皮石斛品质鉴定的常用方法，紫外（UV）指纹图谱可以分析不同物质体系的化学成分和不饱和程度的差异，在中药材产地鉴别方面有较好的应用。

李俊等[13]在浙江、云南和福建建立了13批铁皮石斛样品的HPLC指纹图谱，分析得出结论：铁皮石斛内在质量受品种、栽培基质的影响较大，受产地的影响较小。谢鲁灵枫等[14]构建了霍山铁皮石斛及其他产地铁皮石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱，发现不同产地铁皮石斛的总黄酮、柚皮素、石斛酚含量较高，多糖含量较低，通过共有指纹图谱模式发现5批铁皮石斛的相似度很高，在92.6%～94.8%。李杰等[15]分析了29份云南、浙江、湖南、广西和广东不同产地铁皮石斛醇溶性浸出物的HPLC指纹图谱，分析出13个共有峰，除1份云南样品与对照图谱的相似度为67.6%外，其余样品的相似度均在75.1%～93.4%，多糖、醇溶性浸出物含量与相似度间并没有明显的相关性。王少平等[16]利用HPLC指纹图谱分析铁皮石斛及伪品中柚皮素含量，发现正品铁皮石斛指纹图谱之间有较大相似性，与伪品有较大差异性，且柚皮素含量有一定差异。邓星燕等[17]以石油醚、氯仿和无水乙醇为溶剂提取铁皮石斛样品并进行紫外光谱测定，建立了快速鉴别不同产地铁皮石斛的方法，可以准确区分不同产地的铁皮石斛样品。

相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一种新型的基于PCR的标记系统，其重复性、多态性及共显性等较高，广泛应用在种质资源鉴定、遗传多样性分析和指纹图谱构建等方面[18]。李怀志等[19]使用25对SRAP引物对铁皮石斛进行遗传多样性分析，构建了20份石斛品系的SRAP特征指纹图谱，揭示了铁皮石斛不同品系之间关系的远近，能够为品种鉴定提供准确的信息。

2  铁皮石斛的生物活性物质

化学成分是铁皮石斛发挥活性的物质基础，铁皮石斛的生物活性成分研究始于20世纪80年代，目前发现的生物活性物质主要有多糖、生物碱、黄酮类、芪类等[20，21]。

2.1  多糖

多糖类是铁皮石斛重要的生物活性物质，但不同部位、产地、采收时机及贮存条件等因素对铁皮石斛多糖含量的影响不同，阙彩霞等[22]研究得出华南地区温室产铁皮石斛苗叶片多糖存在于细胞壁和液泡中，茎段多糖存在于细胞质中，苗栽第2年4月的多糖含量达峰值40.85%。徐德林等[23]分析出浙江乐清产铁皮石斛的多糖含量高出云南品系的2～3倍，相同生境下浙江乐清两个品系的多糖含量也有157.21 mg/g的差异，说明地理环境和基因型会导致多糖含量有明显差异。王琦等[24]研究获得了铁皮石斛多糖的积累规律，结果显示多糖及其关键组分甘露糖的含量与培养月龄呈正相关，但各培養月龄多糖含量均在5-6月达到峰值，说明采收季节会显著影响多糖及其组分的含量。Yu等[25]研究了铁皮石斛采后在常温（25 ℃）、低温（4、0 ℃）下贮藏90 d内多糖含量的变化，发现多糖含量呈先增加后减少的趋势，采用低温储藏后多糖含量整体有所增加，且体外抗氧化活性明显高于常温贮藏。

多糖的化学结构包括单糖残基组成与排列顺序、相邻糖残基连接方式及糖链分支等，周桂芬等[26]对14个不同种植基地产铁皮石斛的茎叶多糖含量与单糖组成进行了比较，得出叶中多糖含量约为相应茎中的1/3，茎中多糖主要由甘露糖和葡萄糖组成，叶多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，茎和叶中的多糖中均以甘露糖比例最高。Pan等[27]通过GC-MS分析出铁皮石斛多糖中的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖（摩尔比为0.04∶0.12∶1.00∶0.13）。高云霄等[28]从珠海产鲜铁皮石斛中分离出单一多糖（SDOP），检测其重均分子量为1.66×106，由甘露糖和葡萄糖（摩尔比4.9∶1.0）组成，并推测出SDOP是以1，4-链接为主，存在少量1，2，4-，1，3，4-，1，4，6-分支结构和端基结构的O-乙酰化葡甘露聚糖。雷思敏等[29]从龙石山铁皮石斛分离纯化出中性多糖（DOP-1），分析其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖（摩尔比为3.80∶0.25∶1.50∶3.80∶2.10∶1.30）组成。Zeng等[30]从铁皮石斛内生真菌镰刀菌中提取出一种新多糖（DG2），检测出分子质量为152.8 kDa，是由半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖（摩尔比4.3∶1.9∶2.8∶1.0）组成，主要链接类型有（1→）-β-D-葡萄糖、（1→4）-β-D-葡萄糖、（1→3、6）-β-D-半乳糖和（1→6）-β-D-半乳糖。

现代药理和临床研究证明，铁皮石斛多糖具有抗肿瘤、抗衰老、降血糖和提高免疫力等作用，在恶性肿瘤的辅助治疗以及慢性咽炎、慢性胃炎、糖尿病和久病体虚免疫功能等方面有着广泛的应用，已成为当前研究的热点[31，32]。李杰等[33]用不同纯度铁皮石斛多糖对昆明小鼠灌胃，发现多糖纯度高会使小鼠免疫器官指数、迟发性变态反应、抗体积数和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力等免疫学指标增大，也能显著增强小鼠的碳粒廓清指数、缓解环磷酰胺对小鼠的免疫抑制作用，对脾虚便秘小鼠的肠道微生态平衡和肠道酶活性方面有一定的促进作用[29，34-36]。劳梓钊等[37]发现0.9%铁皮石斛多糖可明显提高果蝇的抗氧化能力，0.3%、0.9%的多糖能提高果蝇SOD、CAT水平，降低MDA含量。欧阳一鸣等[38]研究多糖高剂量组（1.34 g/kg）、中剂量组（0.67 g/kg）、低剂量组（0.335 g/kg）对亚硝基胍（MNNG）诱发的大鼠慢性萎缩性胃炎（CAG）的作用，证实铁皮石斛多糖对CAG大鼠有良好的保护作用，可有效恢复体重并缓解胃黏膜萎缩。何小群等[39]通过腹腔注射戊四氮（PTZ）来建立癫痫大鼠模型，证明了铁皮石斛多糖对PZT诱导后癫痫大鼠脑神经元有保护作用，推测其作用机制是抑制核转录因子（NF-kB）信号通路的激活，从而减轻癫痫的发作程度。童微等[40]通过体外试验研究发现硫酸化和脱乙酰化修饰后的铁皮石斛多糖能够增强RAW264.7巨噬细胞的免疫活性，而羧甲基化修饰表现出了显著的抑制作用。黄杰等[41]研究得出铁皮石斛多糖（DOP）能降低巨噬细胞TNF-α、IL-6、NO的释放水平，并推测DOP可能与促进细胞吞噬活性、降低炎症因子释放水平和改变细胞极化分型有关。钟惠娟等[42]研究得出多糖浓度（44 mmol/L）能显著抑制大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能（EDR），增加胸主动脉中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白（CHOP）及核转录因子-KB（NF-KB）的表达。吴耽等[43]研究得出多糖在浓度（50～300 μg/L）内能起到抗阿司匹林损伤的作用。李静文等[44]分析得出铁皮石斛多糖（PDC）可以降低糖尿病视网膜病变大鼠体内炎症因子（IL-6、TNF-α）的表达，进而抑制血管内皮生长因子（VEGF）表达上调。Fu等[45]通过体外发酵研究了铁皮石斛多糖对人肠道菌群组成和代谢的影响，结果表明多糖可以改善胃肠道健康。

2.2  黄酮类

黄酮类化合物也是铁皮石斛的主要生物活性成分，不同地理来源铁皮石斛的黄酮类化合物成分有很大的差异。梁芷韵等[46]采用HPLC分析了广东、广西、云南等地27批铁皮石斛的黄酮类成分，共标示出13个特征峰，鉴别出6个黄酮碳苷（新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、佛莱心苷和异佛莱心苷）和1个黄酮氧苷（芦丁）7个特征峰。吕朝耕等[47]利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）测定了铁皮石斛的黄酮类成分，结果表明不同产地铁皮石斛中黄酮类成分在组成和含量上存在较大差异，各成分中柚皮素含量最高（26.87 μg/g），其次为圣草酚（1.20 μg/g）与异鼠李素（0.91 μg/g），其余成分都在0.5 μg/g以下。黎晶晶等[48]采用HPLC法鉴定出6种铁皮石斛黄酮类成分，分别是芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、异夏佛托苷、夏佛托苷、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷和柚皮素，可用于铁皮石斛的成分分析及质量评价。黄月纯等[49]比较了丹霞地貌种源、浙江本地种、铁皮兰种铁皮石斛叶黄酮类成分HPLC 特征图谱的差异，得出相同种源叶黄酮类成分基本一致，不同种源成分群组成及比例存在明显差异。

铁皮石斛叶总黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，罗颖懿等[50]发现不同种源的共性黄酮类成分新西兰牡荆苷Ⅱ（芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷）在体外有一定的抗氧化作用，能有效抑制HepG2细胞增殖，并可能通过调控MAPK通路及Bax/Bcl-2途径诱导HepG2细胞凋亡。高海立等[51]研究铁皮石斛叶总黄酮（TFDL）经D101型树脂纯化后的抗氧化活性，结果显示TFDL在DPPH、ABTS+及Fe2+ 3种体系中的抗氧化活性具有浓度依赖性，IC50分别为0.112 3、0.784 5和0.643 4 mg/mL，并且TFDL对DPPH的清除能力最强。周桂芬等[52]对铁皮石斛不同部位种黄酮碳苷类成分及抗氧化作用进行比较，得出叶和花中的黄酮二糖碳苷类含量明显高于茎，根中含量较少，叶中黄酮类成分对DPPH自由基的清除能力优于茎。

2.3  生物碱

生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，1964年犬伏康夫等发现石斛生物碱为倍半萜骨架结构，也是最早分离并进行结构确认的化合物[53，54]。汪群红等[55]用碱性氯仿提取不同来源的铁皮石斛生物碱，发现组培品的总生物碱含量最高（0.091%），野生品（0.085%）次之，人工栽培品（0.043%）最低。唐丽等[56]研究不同生长时间铁皮石斛茎与叶中总生物碱的含量差异，结果表明总生物碱主要集中于叶，1年龄叶中含量最高（0.036%），3年龄以内的总生物碱含量相对较高，但植株生长至4、5年龄时，总生物碱含量明显较低。王自布等[57]研究了铁皮石斛快繁优化及不同时期生物碱含量的积累，结果表明生根壮苗的最佳组合为IBA 1.5 mg/L、香蕉泥100 g/L和活性炭0.1%，生根率达到100%;愈伤组织形成后30 d左右时总生物碱含量（0.36%）最高。王洪秋等[58]研究了不同pH培养液对铁皮石斛原球茎生物碱含量的影响，结果表明培养液pH为5.8时生物碱生产量（3.15 mg/L）达到最高，壳聚糖（15 mg/L）和普鲁兰多糖（100 mg/L）混合处理可明显提高生物碱的积累量，达到了5.07 mg/L。

陈存武等[59]采用HPLC-UV-CL联用测定铁皮石斛生物碱组分清除自由基能力，结果表明霍山铁皮石斛的4种生物碱可降低鲁米诺-双氧水发光体系的发光值，peak10生物碱活性最强，校正清除率达5.2%，而含量较高的peak11校正清除率仅为2.6%。王杰等[60]将鲜铁皮石斛生物碱提取物分为高、中、低剂量（20、10、5 g/kg）组，研究得出鲜铁皮石斛生物碱提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤有明显的抑制作用，推测其机制可能与提高脾脏指数、调节血清中TNF-α和IL-2水平有关。

2.4  其他

目前，有很多学者对铁皮石斛进行不同溶剂萃取来研究提取物的体外抗氧化活性，高维等[61]比较2年生和4年生铁皮石斛水提物对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，发现4年生铁皮石斛提取物对两种自由基的清除能力高于2年生的水提物。谢庆芬等[62]研究霍山铁皮石斛提取物不同极性部位的体外抗氧化活性，分析得出霍山铁皮石斛提取物正丁醇部位在DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及总抗氧化能力上都比较强。

很多动物试验也证明了铁皮石斛提取物在降压、防胃癌、保护皮肤、预防溃疡性结肠炎、修复肌肉损伤等方面的作用。铁皮石斛水提物与醇提物对自发性高血压（Spontaneous hypertension rat，SHR）大鼠有明显的降压作用，兩种提取物都能显著降低SHR大鼠的血压，醇水提取物降压效果优于相同剂量的水提物，优于苯磺酸氨氯地平，醇水两提物及水提物对血浆AngⅡ激素含量没有影响[63，64]。姚尧等[65]研究得出铁皮石斛水提物可有效改善糖尿病小鼠体内肠道菌群，提高其免疫力，并使小鼠体内脂质代谢恢复平衡，减少动脉粥样硬化的发生概率。赵佩等[66]研究了铁皮石斛甲醇提取物对小鼠溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC）的治疗作用及机制，发现醇提物对UC小鼠有治疗作用，并推测可能是通过抑制IFN-γ、TNF-α释放，阻断炎症的放大效应而达到治疗效果。田林娜等[67]研究铁皮石斛水提物对运动性损伤的修复作用，结果表明水提物能正向调控C2C12细胞和骨骼肌组织的EGFR表达水平，起到促进骨骼肌细胞增殖的作用，对骨骼肌运动性损伤起到一定的修复作用。赵益等[68，69]研究了铁皮石斛提取物（DOE）通过调节内源性代谢产物及相关基因预防胃癌前病变的作用机制，结果表明DOE能够降低鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate，S1P）的表达，从而预防胃癌的发生。卢秋静等[70]研究铁皮石斛水提物（DOE）抗小鼠皮肤光损伤的保护作用，结果表明水提物可减少小鼠皮肤组织内的各种活性氧自由基（ROS），提高小鼠皮肤组织内的基质金属蛋白酶抑制因子，从而保护紫外光线引起的皮肤光损伤。

3  结论

铁皮石斛是中国的传统药用植物，化学成分包含多糖、黄酮类、生物碱、芪类、蛋白质、氨基酸、矿质元素、挥发油等，多糖、黄酮类及生物碱等成分不仅是通过色谱指纹图谱判别铁皮石斛的重要依据，也是铁皮石斛主要的生物活性成分，国内外许多学者对这些活性成分在铁皮石斛不同生长期不同采收期含量的变化、结构分析及药理作用做了大量的研究。笔者从不同角度总结了近几年国内外关于铁皮石斛指纹图谱及生物活性成分的研究，以期为铁皮石斛的鉴别、品质评价和药物开发提供一定的理论依据和科学参考。

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