不同烤烟品种烟叶氨基酸代谢差异分析

李洪臣　朱顺成

摘要：为筛选优质烤烟品种，明确烤烟品种间烟叶氨基酸代谢差异情况，研究了豫烟10号、NC89和中烟100 3个品种烟叶生长过程中脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代谢关键酶活性及氨基酸含量动态变化。结果表明，叶龄20 d时，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、鸟氨酸转氨酶、脯氨酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸激酶活性均呈先升高后降低趋势，峰值在叶龄30～40 d，豫烟10号酶活性最高;烟叶中脯氨酸含量不断增加，叶龄30 d后，豫烟10号脯氨酸含量最高。游离氨基酸含量呈先升高后降低再升高趋势，在叶龄各时期豫烟10号均最高。

关键词：烤烟;烟叶;氨基酸;酶活性

中图分类号：S572         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）05-0088-04

Abstract： To screen high-quality flue-cured tobacco varieties and clarify the differences in amino acid metabolism among flue-cured tobacco varieties， the dynamic changes of proline， glutamic acid and aspartic acid metabolism key enzyme activities and amino acid content during the tobacco leaf growth of Yuyan 10， NC89 and Zhongyan 100 were studied. The results showed that at 20 days of leaf age， the activities of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid synthetase， ornithine aminotransferase， proline dehydrogenase， aspartate aminotransferase and aspartate kinase all increased first and then decreased， the peak is at leaf age 30～40 d， Yuyan 10 had the highest enzyme activity; the content of proline in tobacco leaves increased continuously; after 30 days of leaf age， the content of proline in Yuyan 10 changed to highest. The content of free amino acids increased first， then decreased and then increased， and Yuyan 10 was the highest at each stage of leaf age.

Key words： flue-cured tobacco; tobacco leaf; amino acid; enzyme activity

氨基酸是烟草中重要的含氮化合物，也是香气的主要来源之一[1]。在烟叶生长、烘烤和醇化过程中，氨基酸与还原糖发生非酶促棕色化反应（美拉德反应）是烟草中重要的致香反应，可形成对烟草香味有重要影响的吡咯、吡嗪和呋喃等物质，苯丙氨酸等部分氨基酸還可以直接分解为苯甲醇、苯乙醇等香味物质[2，3]。研究表明，添加天冬氨酸和脯氨酸等调控美拉德反应程度，可使烟香浓郁，香气醇和细腻，降低刺激性，改善余味[4-6]。烟叶游离氨基酸含量与感官品质总体呈负相关，且烟叶游离氨基酸含量在烘烤过程先上升后大幅下降[7]。烟叶生长过程中合成更多的氨基酸参与美拉德反应，有利于改善烟叶感官质量。烟叶中氨基酸含量较高的为脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸[8]，在多种酶的作用下合成与降解。烟叶中氨基酸代谢动态变化鲜见报道，品种间氨基酸代谢差异尚不明确。试验从氨基酸代谢关键酶入手，研究了不同品种烟叶氨基酸动态变化情况，以期为筛选优质烤烟品种提供参考。

1  材料与方法

1.1  供试材料

试验在河南农业大学科教园区开展，土壤为壤质潮土，耕层含有机质9.38 g/kg、全氮1.22 g/kg、速效氮76.57 mg/kg、速效磷27.48 mg/kg、速效钾84.39 mg/kg，pH 7.70。供试烤烟品种为豫烟10号、中烟100和NC89。

1.2  试验设计

试验采用随机区组设计，每个品种100株，重复3次，行株柜为120 cm×50 cm，氮肥施用量为45 kg/hm2、磷肥施用量为90 kg/hm2、钾肥施用量为135 kg/hm2，所用肥料为硝酸铵、重过磷酸钙和硫酸钾。5月10日施入基肥，6月10日追肥，基追肥比为7∶3。其他田间管理及病虫害防治均按优质烟生产技术方案进行。

1.3  测定项目及方法

选取整齐一致的单株，以中部叶10～12片叶（自下向上数）为研究对象，以叶长1.5 cm时开始挂牌计算叶龄，分别于叶龄20、30、40、50 d、烘烤前（60 d烘烤）取样，各品种重复取样3次，用冰盒带回实验室，测定氨基酸代谢相关指标。

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性的测定参照文献[9，10]的方法，利用盐酸羟胺比色法测定;鸟氨酸转氨酶（δ-OAT）活性的测定参照文献[11]的方法;脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性的测定参照文献[12]的方法;脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮法[13，14];天冬氨酸转氨酶（AAT）活性的测定参考文献[15]的方法;天冬氨酸激酶（AK）活性的测定参考文献[16]的方法;游离氨基酸总量的测定采用茚三酮显色法[17]。

1.4  數据处理

采用SPSS 17.0数据处理系统和Microsoft Excel 2010软件对数据进行分析和作图。

2  结果分析

2.1  不同品种Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活性的差异

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是谷氨酸合成途径中的限速和调节酶[18]。由图1可知，P5CS的活性在叶龄20～30 d大幅升高至峰值之后下降，在叶龄30～50 d大幅下降。豫烟10号的P5CS活性高于其他品种;NC89最低且峰值平稳，变幅不大。品种间P5CS活性存在差异，P5CS活性较高的品种脯氨酸合成能力较强。

2.2  不同品种鸟氨酸转氨酶活性的差异

鸟氨酸转氨酶（δ-OAT）是调节脯氨酸合成途径中鸟氨酸途径的核心关键酶[19]。由图2可知，δ-OAT的活性在叶龄20～40 d大幅升高至峰值之后下降，在叶龄40 d至烘烤大幅下降。豫烟10号的δ-OAT活性高于其他品种，NC89最低。品种间δ-OAT活性存在差异，δ-OAT活性较高的品种脯氨酸合成能力较强。

2.3  不同品种脯氨酸脱氢酶活性的差异

脯氨酸脱氢酶（ProDH）是脯氨酸降解的限速酶[20]。由图3可知，ProDH的活性在叶龄20～30 d大幅升高至峰值之后下降，在叶龄30 d至烘烤前大幅下降。叶龄20～30 d豫烟10号的ProDH与NC89差异不大，中烟100最高;叶龄40～50 d豫烟10号显著低于其他品种，NC89最高。品种间ProDH活性存在差异，ProDH活性较高的品种脯氨酸降解能力较强。

2.4  不同品种脯氨酸含量的差异

脯氨酸的积累一部分来源于酶的作用，另一部分来自蛋白质的降解，成熟后期积累量与逆境抗性有关[21，22]。由图4可知，脯氨酸含量不断上升，在叶龄20～40 d增幅较小，在叶龄40 d至烘烤前大幅升高。叶龄20～30 d豫烟10号的脯氨酸含量最低;叶龄40～50 d豫烟10号最高，中烟100与NC89相差不大，叶龄50 d至烘烤前含量大幅升高。品种间脯氨酸含量和积累存在差异，豫烟10号脯氨酸含量较高。

2.5  不同品种天冬氨酸转氨酶活性的差异

天冬氨酸转氨酶（AAT）是天冬氨酸家族氨基酸合成的关键酶[23]。由图5可知，AAT的活性在叶龄20～30 d升高至峰值之后下降，在叶龄30 d至烘烤前大幅下降。叶龄20～30 d豫烟10号的AAT活性显著高于其他品种，中烟100与NC89差异不大;叶龄40～50 d豫烟10号与NC89相差不大，中烟100最低。品种间AAT活性存在差异，AAT活性较高的品种天冬氨酸家族氨基酸合成能力较强。

2.6  不同品种天冬氨酸激酶活性的差异

天冬氨酸激酶（AK）也是合成天冬氨酸家族氨基酸的关键酶[23]。由图6可知，AK的活性在叶龄20～40 d大幅升高至峰值之后下降，在叶龄40 d至烘烤前大幅下降。叶龄20～40 d豫烟10号的AK活性大幅升高，由最低转变为最高，并显著高于其他品种，中烟100与NC89差异不大;叶龄40～50 d豫烟10号活性最高，NC89最低。品种间AK活性存在差异，AK活性较高的品种天冬氨酸家族氨基酸合成能力较强。

2.7  不同品种游离氨基酸总量的差异

游离氨基酸既是合成蛋白质的原料，又是蛋白质降解的产物。由图7可知，游离氨基酸总量在叶龄20～40 d升高至峰值之后下降，在叶龄40～50 d大幅下降，之后在烘烤前有小幅的上升。豫烟10号的氨基酸含量高于其他品种，NC89最低。品种间游离氨基酸总量存在差异，这与氨基酸代谢酶和蛋白质的降解作用有关。

3  小结与讨论

氨基酸以游离状态存在于烟叶中，在烟叶调制过程中，有些氨基酸降解产生烟叶香气前体物，而有些转化成挥发性羰基化合物[24]。豫烟10号的P5CS和δ-OAT活性高于其他品种，NC89最低且峰值平稳，变幅不大。烟叶中存在以谷氨酸（Glu）和鸟氨酸（Orn）为底物合成脯氨酸的两条途径，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径。P5CS和δ-OAT分别是两条合成途径的关键酶。脯氨酸的降解由2个连续的线粒体酶催化，即ProDH和P5CDH，其中ProDH是脯氨酸降解的限速酶[25]。因此品种间P5CS、δ-OAT和ProDH活性存在差异，活性较高的品种豫烟10号脯氨酸合成能力较强，烟叶的脯氨酸含量也证明了这一点。

天冬氨酸家族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。天冬氨酸家族氨基酸合成的关键酶是AAT和AK。叶龄20～30 d，豫烟10号的AAT和AK活性显著高于其他品种，中烟100与NC89差异不大;叶龄40～50 d，豫烟10号与NC89相差不大，中烟100最低。已有研究也表明，过量表达AAT基因天冬氨酸家族氨基酸的含量显著提高，AK主要调节赖氨酸合成。同时，AK活性高对蛋氨酸、苏氨酸与异亮氨酸积累有利[26，27]。品种间AAT和AK活性存在差异，AAT和AK活性较高的品种天冬氨酸家族氨基酸合成能力较强。

豫烟10号的游离氨基酸含量高于其他品种，NC89最低。结合相关氨基酸代谢的酶活性与脯氨酸含量的变化，品种间氨基酸含量存在差异，这与氨基酸代谢酶有关，同时也与蛋白质的降解作用有关。

参考文献：

[1] HECHT S S，SCHMELTZ I，HOFFMANN D. Nitrogenous compounds in cigarette smoke and their possible precursors[J].Recent advances in tobacco science，1977（3）：59-93.

[2] BURTON H R，BUSH L P，HAMILTON J L. Effect of curing on the chemical composition of burley tobacco[J].Recent advances in tobacco science，1983（9）：91-153.

[3] WAHLBERGI，KARLSSON K，AUSTIN D J，et al. Effects of flue-curing and ageing on the volatile，neutral and acidic constituents of Virginia tobacco[J].Phytochemistry，1977，16（8）：1233-1235.

[4] 朱智志，廖新成，李光照，等.大枣浸膏的Maillard反应及其在烟草中应用研究[J].安徽农学通报，2008，14（7）：40-42.

[5] 黄  龙，朱  巍，程志昆，等.红枣提取物的Maillard反应制备烟用香料的研究[J].湖北农业科学，2011，50（8）：1673-1676.

[6] 许春平，肖  源，赵亚奇，等.金钱菇香料的制备及其在卷烟中的应用研究[J].农产品加工·创新版，2013（1）：34-37，44.

[7] 过伟民，郭建华，董洪旭，等.烤烟游离氨基酸与感官品质的关联及烘烤过程的变化规律研究[J].中国烟草学报，2018，24（6）：16-25.

[8] 赵  田，史宏志，姬小明，等.不同类型烟草游离氨基酸组成和含量的差异分析[J].中国烟草学报，2011，17（2）：13-17.

[9] HAYZER D J，LEISINGER T. The gene-enzyme relationships of proline biosynthesis in Escherichia coli[J].Journal of general microbiology，1980，118（2）：287-293.

[10] 韩晓玲.小冠花抗L-羟基脯氨酸（Hyp）变异系离体筛选及其耐盐性研究[D].西安：西北大学，2006.

[11] 黄诚梅.甘蔗脯氨酸积累与△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因克隆及转化研究[D].南宁：广西大学，2007.

[12] 赵福庚，刘友良.胁迫条件下高等植物体内脯氨酸代谢及调节的研究进展[J].植物学通报，1999，16（5）：540-546.

[13] 张宪政.作物生理研究法[M].北京：农业出版社，1992.

[14] 职明星，李秀菊.脯氨酸测定方法的改进[J].植物生理学通讯，2005，1（3）：355-357.

[15] 吴良欢，蒋式洪，陶勤南.植物转氨酶（GOT和GPT）活度比色测定方法及应用[J].土壤通报，1998，29（3）：136-138.

[16] BRENNCCKC K，SOUZA N A，LUGLI J，et al. Aspartate kinase in the maize mutants Askl-LT19 and OPAQUE-2[J].Phytochemistry，1996，41（3）：707-712

[17] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.

[18] YAMADA M，MORISHITA H，URANO K，et al. Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress[J].J Exp Bot，2005，56（417）：1975-1981.

[19] 赵瑞雪，朱慧森，程珏红，等.植物脯氨酸及其合成酶系研究进展[J].草业科学，2008，25（2）：90-96.

[20] 赵贵林，陈  强，胡国霞，等.水稻脯氨酸代谢关键酶对水分胁迫的响应[J].干旱地区农业研究，2011，29（3）：80-83.

[21] XIN Z，BROWSE J. Cold comfort farm：The acclimation of plants to freezing temperature[J].Plant cell and environment， 2000，23（9）：893-902.

[22] 汤章城.逆境条件下植物脯氨酸的积累及其可能的意义[J].植物生理学通讯，1984（1）：15-21.

[23] JOSHI V. Recent progress in deciphering the biosynthesis of aspartate-derived amino acids in plant[J].Mol Plant，2010，   3（1）：54-65.

[24] 呂雪娟，梁兰兰，黄华京，等.游离氨基酸含量对食品风味特征的影响[J].食品科学.1996，17（3）：10-12.

[25] 王  康，刘艳香，董  洁，等.盐胁迫对菊苣幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响[J].草地学报，2011，19（1）：102-106.

[26] ZHOU Y，CAI H M，XIAO J H，et al. Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted in nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds[J].Theore Appl Genet，2009，118（7）：1381-1390.

[27] GALILI G. Regulation of lysine and threonine synthesis[J].Plant cell，1995，7（7）：899-906.