水稻OsLecRK基因的亚细胞定位分析

闸雯俊 杨芳 张艳茗

摘要：凝集素类受体蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶，但水稻（Oryza sativa L.）中OsLecRK家族的亚细胞定位及其生物学功能尚未清楚。依据NCBI公布的水稻OsLecRK的ORF序列设计引物，从水稻粳稻品种叶片cDNA中扩增得到目的片段，构建OsLecRK -GFP融合瞬时表达载体，转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位。激光共聚焦观察结果表明，水稻OsLecRK蛋白主要存在于细胞质，为进一步研究其功能奠定了基础。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；OsLecRK；亚细胞定位

中图分类号：S511 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）17-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.028 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Lectin-like receptor kinase（LecRK） is a family of proteins which is unique and universal in plants. However， subcellular localization and biological function of OsLecRK family in rice（Oryza sativa L.） are largely unknown. OsLecRK gene was amplified from Nipponbare leaves cDNA based on the published ORF sequence on NCBI. Subcellular localization of OsLecRK protein was conducted by construction of transient expression vector OsLecRK-GFP and transformation of rice protoplasts. The confocal microscopy results showed that OsLecRK protein was located mainly in the cytoplasm， and built a good foundation for further research on the function of OsLecRK.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； OsLecRK； subcellular localization

水稻（Oryza sativa L.）是世界的主要糧食作物之一，全球超过一半人口以水稻作为主食[1]。水稻是中国最重要的口粮作物，常年种植面积约3 000万hm2，占世界水稻种植总面积的1/4。因此，水稻的种植安全与中国农村经济发展和口粮安全密不可分。

凝集素类受体蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶。自1996年从拟南芥中第一次分离得到该家族成员Ath.lecRK后，人们已从多种植物中克隆到多个该类蛋白基因。研究表明，LecRK基因对植物生长发育有一定的作用。拟南芥sgc是一种LecRK基因失活的突变体，由T-DNA插入At3g53810引起，突变体sgc由花粉时期开始，所有的花粉粒都开始变形和萎缩，从而引起雄性不育[2]。LecRK基因还广泛参与植物与生物和非生物胁迫的互作。LecRK胞外的凝集素受体结构域一直被认为是与根瘤菌的共生和病原体的抵抗相关。最近的研究也证明了这个观点，新发现的水稻抗稻瘟病Pi-d2就是一种包含甘露糖特异的凝集素受体蛋白激酶[3]。研究人员还利用T-DNA插入和RNAi方法将拟南芥中的LecRK4.1、LecRK4.2、LecRK4.3这3个基因分别敲除掉，结果显示任一基因的失活可增强拟南芥对萌发时ABA的应答[4]；与之相反，另一株突变体LecRK-b2在萌发时期对ABA的敏感度会降低，同时还发现LecRK-b2基因也参与发育早期对盐压力和渗透压的应答[5]。

通过亚细胞定位可以了解蛋白质在细胞中的具体位置，而蛋白质的功能与其在细胞中的定位紧密相关，从而可以对基因的功能进行预测。研究蛋白亚细胞定位已有多种方法，常用的主要有融合报告基因定位法、免疫组织定位法、共分离标记酶辅助定位法等[6]，其中以绿色荧光标记GFP的应用最为广泛[7，8]。绿色荧光标记蛋白质在蓝光激发下发出绿色荧光，可以作为荧光标记与目的蛋白质融合表达并转运到细胞特定的组织来发挥功能，通过检测绿色荧光在细胞中的位置来获得目的蛋白质的亚细胞定位信息。本研究通过LecRK基因的克隆和LecRK-GFP融合蛋白质的亚细胞定位，为深入研究该基因在水稻中的功能奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大肠杆菌Top10，由粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室提供。

1.1.2 水稻材料 粳稻品种中花11（Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Zhonghua11）原种，由本实验室提供，用于提取水稻原生质体。

1.1.3 植物表达载体 植物表达载体为pBWA（V）HS-gfp载体质粒。

1.2 方法

1.2.1 中花 11 cDNA的制备 采用Trizol法提取中花11叶片组织的总RNA。采用TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM试剂盒将提取的中花11总RNA反转录为cDNA。反应体系如表1所示，30 ℃，10 min；42 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。将制备好的cDNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 亚细胞定位瞬时表达载体的构建 根据水稻LecRK基因在NCBI数据库中序列设计引物，以中花11的cDNA为模板，扩增带有酶切位点的LecRK的ORF全长（去除终止子）。PCR引物为LecRK F（5′-ATGGCACCTCTCCTGTTCTTGC-3′）、LecRK R（5′-TCATGCGAGTGAACTGATATAG-3′）。

采用10 μL体系进行PCR反应，各反应物浓度如表2所示。PCR 反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.0 min，重复34个循环；72 ℃延伸10 min。扩增完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。目的基因片段进行切胶回收并纯化。将纯化的目的基因片段连接到pMD18-T克隆载体上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，提取质粒后进行测序分析。将测序结果正确的菌种进行保存并命名为pBWA（V）HS-OsLecRK-GFP。

1.2.3 水稻中花11原生质体的提取 将水稻去壳后，以70%乙醇清洗2 min，再以0.5%氯化汞清洗15 min，然后种植于1/2 MS培养基，28 ℃暗培养8～14 d。取幼苗，把根切下后浸在0.6 mol/L甘露醇中，用无菌刀片切成0.5 mm的小块，放入10 mL酶解液[2.5% cellulase R-10（Yakult）、0.75% macerozyme R-10（Yakult）、0.6 mol/L D-甘露醇、10 mmol/L MES（pH 5.7）]，55 ℃加热10 min，此时颜色变为深棕色，自然冷却之后再加入0.1% BSA、10 mmol/L CaCl2，加 ddH2O至10 mL，于150 mL三角瓶中28 ℃、50 r/min避光孵育4～5 h。孵育结束后加入等体积的W5 solution[154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES（pH 5.7）]，轻轻摇匀使原生质体充分释放。用150目不锈钢细胞筛将液体过滤到干净的培养皿中，再用电动移液器小心转移至50 mL圆底离心管中，4 ℃、100 g吊篮离心8 min收集原生质体。余少量上清液将沉淀轻轻摇散，小心以4 mL W5 solution将原生质体重新冲洗悬浮，4 ℃、100 g吊篮离心4 min。去上清液，小心地以4 mL Mmg solution[0.4 mol/L D-甘露醇、20 mmol/L MgCl2、5 mmol/L MES（pH 5.7）]将原生质体重新沖洗悬浮，4 ℃、100 g吊篮离心4 min。去上清液，以 2 mL Mmg solution重新悬浮（此时取20 μL悬浮液进行镜检）。

1.2.4 水稻中花11原生质体的PEG转化 提取的水稻原生质体冰浴30 min，23 ℃、100 g吊篮离心2 min，去上清液。用转化数N×100 μL Mmg solution重新悬浮原生质体，以备转化。2 mL离心管中先加入10 μL亚细胞定位载体，以及10 μL细胞核指示载体Ghd7-CFP或PXDR-OsH2A混匀，再用剪口枪头吸取100 μL悬浮原生质体轻弹混匀，最后加入120 μL 40% PEG3350[0.4 mol/L D-甘露醇、100 mmol/L CaCl2、40%（V/V）PEG3350]轻弹混匀，室温孵育20 min。加入500 μL W5 solution混匀终止反应，23 ℃、100 g吊篮离心2 min。去掉大部分上清液，将沉淀转移至有1.5 mL W5 solution的12孔板中，28 ℃暗培养过夜（16 h以上）。次日将培养液转移到2 mL离心管中23 ℃、100 g吊篮离心2 min，去掉大部分上清液，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 OsLecRK基因的克隆与亚细胞定位载体的构建

以中花11 cDNA为模板，扩增OsLecRK基因到终止密码子前的全长ORF序列，长2 426 bp。将目的片段连接到pBWA（V）HS-GFP载体上，转化大肠杆菌Top10，取PCR鉴定为阳性克隆的质粒（图1）。测序结果表明，克隆序列正确，载体构建成功（图2）。

2.2 OsLecRK蛋白质的亚细胞定位

提取转染级别的质粒，在40% PEG3350的介导下转入水稻原生质体，28 ℃暗培养16 h后，激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号。结果表明，OsLecRK蛋白质分主要布于细胞质中（图3）。

3 小结与讨论

对目的蛋白质进行亚细胞定位是一种较为直观的研究方法，可以通过目的蛋白质在细胞中的定位情况来预测其功能。目前，被广泛应用的能进行亚细胞定位的报告基因主要是绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。绿色荧光蛋白是细胞生物学和分子生物学研究中的一个重要工具，绿色荧光蛋白相对分子质量很小，能与多种不同的蛋白质N端或C端融合而保持其天然蛋白质的特性，因此是一种直观性很强的遗传标记物[9]。本研究利用融合绿色荧光蛋白及水稻原生质体瞬时表达技术对水稻OsLecRK蛋白进行了亚细胞定位。与空载相比，OsLecRK蛋白质在细胞中的分布存在差异。OsLecRK蛋白亚细胞主要定位于细胞质的结果为进一步筛选其互作蛋白，研究其功能奠定了基础。

参考文献：

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[5] DENG K，WANG Q，ZENG J，et al. A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response[J].Journal of Plant Biology，2009，52（6）：493-500.

[6] 邢浩然，劉丽娟，刘国振.植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J].华北农学报，2006，21（S2）：1-6.

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[9] 李 欢，杨皓宇，燕景洲，等.GFP在植物分子生物学研究中的应用[J].生物学杂志，2008，25（5）：55-57.