湖北省羊衣原体流行病学调查

吴修竹 刘威 袁芳艳 周丹娜 刘泽文 杨克礼 段正赢 郭锐 吴雪军 田永祥 程太平

摘要：利用间接血凝（IHA）和酶联免疫吸附测定（ELISA），对湖北省羊养殖场进行了衣原体流行病学调查。结果表明，羊衣原体在湖北省平均阳性率为10.7%，湖北省羊衣原体感染率保持稳定。

关键词：羊衣原体；IHA；ELISA；流行病学；湖北省

中图分类号：S852.67 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0093-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.023

Epidemiological Survey of Chlamydia Goat in Hubei Province

WU Xiu-zhu1，LIU Wei2，YUAN Fang-yan2，ZHOU Dan-na2，LIU Ze-wen2，YANG Ke-li2，

DUAN Zheng-ying2，GUO Rui2，WU Xue-jun3，TIAN Yong-xiang2，CHENG Tai-ping1

（1.College of Animal Sciences，Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China； 2.Hubei Academy of Agricultural Sciences， Animal Husbandry and Veterinary Research Institute/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animals Bacteriosis（Ministry of Agriculture）， Wuhan 430064， China；3.Zhejiang Provincial Center for Animal Disease Control， Hangzhou 311199， China）

Abstract： In this study， indirect hemagglutination kits and ELISA were used to investigate the epidemiology of Chlamydia in goat farms in different regions of Hubei province. The results showed that the average positive rate of chlamydia goat in these regions is 10.7%. The rate of Chlamydia in Hubei province is basically the same as that of previous years.

Key words： Chlamydia； goat； indirect hemagglutination test； serological investigation； Hubei province

衣原体是一类专性细胞内寄生，是介于细菌和病毒间的革兰氏阴性微生物[1]，可感染人及动物，引起相应的疾病。此外，该病还是重要的人兽共患传染病[2，3]。衣原体病原被分为衣原体属（Chlamydia）和嗜衣原体属（Chlamydophila）[4]。衣原体属包括沙眼原体（Ct）、猪衣原体（C.suis）和鼠衣原体（C.muridarum）；嗜衣原体属包括流产嗜衣原体（C.abortus）、豚鼠嗜衣原体（Ch.caviae）、猫嗜衣原体（Ch.felis）、家畜嗜衣原体（Ch.pecorum）、肺炎嗜衣原体（Cpn）和鹦鹉热嗜衣原体（Ch.psittaci）[5]。

衣原体具有严格的寄生性，必须在活的细胞内才能生长繁殖。绝大多数衣原体能在6～8日龄的鸡胚卵黄囊中生长繁殖，有的衣原体还能在小鼠脑内接种生长，给小鼠腹腔接种也能增殖。常用于培养衣原体的传代细胞有Hela细胞、L细胞和小鼠成纤维细胞等。衣原体是自然界中分布最广的病原体之一，能引起各种哺乳动物、家禽、野禽类和人感染而发生多种疾病。病原主要来源于病畜的排泄物、血液、粪便、流产胎儿及分泌物和死亡后的组织中。通过污染的尘土和飞沫，经呼吸道或消化道传播[6]。本研究采用间接血凝（Indirect hemagglutination assay，IHA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）对湖北省羊衣原体感染情况进行了调查和分析，为进一步了解羊衣原体病在湖北省的流行情况奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清 测定血清来自于湖北省各地区羊养殖场，共计116份；羊衣原体阳、阴性标准血清来自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.1.2 试剂 衣原体IHA冻干抗原、阴性血清、阳性血清、稀释液，购自中国农业科学院兰州兽医研究所（批号20170727204）；包被液：pH 9.6的碳酸盐缓冲液；洗涤液：含吐温-20终浓度0.5%的PBS溶液，pH 7.4；稀释液：含脱脂奶粉2%的PBS；封闭液：含脱脂奶粉5%的PBS，二抗：Peroxidase-Conjugated Immuno Pure Rabbit Anti-Goat IgG（H+L）（美国，Pierce公司）。

1.2 检测方法

1.2.1 间接血凝试验 将稀释液加入96孔反应板110度V型中，每孔75 μL；取被检血清25 μL加入第一孔，呈4倍遞增稀释3孔（即1∶4、1∶16、1∶64）。第3孔弃去25 μL，同时设阴性对照、阳性对照和空白对照各2孔；每孔加抗原25 μL，置于微型振荡器上振荡2 min，盖上玻璃板在37 ℃反应2 h。判定结果：对照各孔均成立，被检血清1∶16孔出现“++”及以上凝集者为阳性；1∶4孔出现“+”及以下凝集者为阴性；1∶4孔出现“++”至1∶16孔出现“+”以下者为可疑。

1.2.2 酶联免疫吸附测定 将纯化后蛋白包被ELISA板，4 ℃过夜；用TBST洗涤ELISA板3次，每次5 min，用5%脱脂奶粉封闭，TBST洗涤，分别加入待检血清，37 ℃孵育1 h；TBST洗涤ELISA板3次，每次5 min，加入兔抗羊二抗37 ℃孵育1 h，洗涤ELISA板；最后加入显色液，37 ℃孵育10 min，利用酶标仪读取OD630 nm数值。

2 结果与分析

2.1 ELISA最佳抗原包被浓度与血清稀释度

血清滴定方陣试验结果如表1、表2所示。选择阳性OD630 nm在1.0左右，阳性值与阴性值比值较高的稀释度作为最佳反应条件。本试验选取MOMP稀释值为2 μg/mL，血清80倍稀释为最佳稀释度。

2.2 临界值确定

根据50份羊衣原体抗体阴性血清检测结果的OD630 nm平均值（X）为0.240，SD值为0.089，临界值为X+3SD=0.507。

2.3 IHA和ELISA检测羊衣原体病抗体结果及符合率

采用IHA检测了101份羊血清样品，发现显示阳性包括疑似的样品数为10份，阳性率为9.9%。采用ELISA检测了96份羊血清样品，通过临界值得到阳性样品数为11份，阳性率为11.5%，综合两者得到综合阳性率为10.7%。采用IHA和ELISA同时检测湖北地区86份临床血清样品，其中两种试验方法检测结果同为阳性的样品数有3份，IHA为阳性而ELISA为阴性的样品数有1份，其符合率为75%。IHA为阴性而ELISA为阳性的样品数有6份，两种试验方法检测结果同为阴性的样品数有76份，其符合率为92.7%，整体符合率为91.8%。

此外，还对浙江省采集的96份样品进行了检测，浙江省羊衣原体阳性率仅为5.2%。

3 小结与讨论

衣原体引起的羊地方性流产作为一种重要的人兽共患传染病，不仅给养羊业造成了相当大的经济损失，也危及人体健康[7]。怀孕期的妇女被流产嗜衣原体感染可能会导致严重的败血症进而发生流产或产下死胎。流产嗜衣原体一般通过口腔或呼吸道进行传播，被感染的羊只在通常情况下没有明显的临床症状，但当母羊怀孕时就会造成流产或产下虚弱的羔羊，羔羊一般不会存活[8]。流行病学调查为该病的监测与预警提供了数据支撑[9]。

衣原体病的常见检测方法有免疫荧光法（IFA）、补体结合试验（CFT）、间接补体结合试验（ICF）、间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。本研究初步建立了衣原体ELISA检测方法，优化后的条件为蛋白最佳包被浓度为2 μg/mL，血清最佳稀释倍数为80倍，临界值为X+3SD=0.507。同时利用ELISA和IHA方法对临床采集的血清进行检测，结果发现，ELISA的敏感性要显著高于IHA，阳性符合性为75%，阴性符合率较高，为92.7%。IHA试验所用器材简单，操作简便，便于基层单位使用，但不同环境下甚至不同人员操作下的检验结果会存在一定的差异性，重复性较ELISA差，ELISA试验操作相对复杂，对仪器设备和操作人员有一定的要求，但其敏感性和重复性显著高于IHA。

流行病学调查结果显示，湖北省羊衣原体感染率基本与往年持平，但高于浙江省，应加强养羊业的科学饲养管理，加大各地区进出口检疫以及对被感染羊只的处理和淘汰工作，饲养人员也应当重视该病对人员的危害，制定有效的防范措施，降低该病的传播。

参考文献：

[1] YIN L，KALMAR I D，BODEN J，et al. Chlamydial infections in Chinese livestock[J]，Rev Sci Tech Off Int Epiz，2013，32（3）；3.

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[4] STEPHENS R S，MYERS G，EPPINGER M，et al. Divergence without difference：Phylogenetics and taxonomy of Chlamydia resolved[J].Pathogens & Disease，2009，55（2）：115-119.

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