不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响

黄薇++袁斌++万鹏++金利容++黄民松

摘要：研究了大麗轮枝菌（Verticillium dahliae）在不同钾钠比（K+/Na+）的查氏培养基中生长的生物学特性及致病力的变化。结果表明，菌株在05.248的固体培养基上生长呈近W型。与常规查氏培养基（CK，K+/Na+为1.312）相比，菌株在05.248的固体培养基上，生长速率无显著性差异；在K+/Na+为5.248的固体培养基上，菌核型菌株的微菌核产量最大；但在无K+条件下同样有微菌核的产生，说明K+对微菌核的产生有一定影响，在适中情况下会增加菌株微菌核的产量，但非必要产生因素。K+浓度会影响到菌株的致病力，当K+/Na+≤2.624时，随着K+浓度的上升，菌株的致病力有所增强，当K+浓度过高，K+/Na+达到26.24时，菌株的致病力反而减弱。在K+浓度不变时，Na+浓度与病原菌的致病力初步呈正相关，Na+浓度升高，钾钠比下降，病原菌的致病力增强；反之亦然。

关键词：查氏固体培养基；钾钠比（K+/Na+）；微菌核；致病力

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5815-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.022

The Influence of Different Ratios of K+/Na+ in Czapeks Medium to Biological Characters and Virulence of Verticcilium dahilae

HUANG Wei， YUAN Bin， WAN Peng， JIN Li-rong， HUANG Min-song

（Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract：The biological characteristic and virulence of Verticcilium dahilae strains were observed and recorded of strains on Czapeks solid medium with different ratio of K+/Na+. The results showed that the growth rates of strains were signifcantly different when the ratio of K+/Na+ were less than or equal to 5.248， however， there were no signifcant differences when the ratio of K+/Na+ were greater than 5.248. The growth curves appeared M-form when the ratio of K+/Na+ less than or equal to 5.248， and appeared W-form when the ratio of K+/Na+ greater than 5.248. The yield of microsclerotia（MS） was biggest while the ratio of K+/Na+ was less equal to 5.248， but microsclerotia aslo exsited in the solid meddium which lacking of potassium. It showed that potassium affected the formation of microsclerotia，it would obviously improve the yield of microsclerotia in the appropriate content， but it was not necessarily produce factors. K+ concentration would affect the pathogenicity of strains， when the ratio of K+/Na+ were less than or equal to 2.624， by increasing K+ concentration， the pathogenicity of strains were enhanced. When the ratio of K+/Na+ was equal to 26.24， K+ concentration was very high， the pathogenicity of strain was weakened. In the case of the same K+ concentration， the virulence of strains had positive correlation with Na+ concentration. Increasing the concentration of Na+， the ratio of K+/Na+ was decreased，and the pathogenicity of strains was increased and vice versa.

Key words： Czapekssolid medium； ratio of K+/Na+； microsclerotia； pathogenicity

棉花的黄萎病为一种土传性病害，致病菌有大丽轮枝菌（Verticillium dahilae）和黑白轮枝菌（V. alboatrum）[1]，早在20世纪90年代，张绪振等[2]研究发现，中国棉花黄萎病的致病菌主要为大丽轮枝菌。大丽轮枝菌的寄主范围广，目前已达到660多种，且该病原菌的变异程度高，产生的微菌核的抗逆性非常强，可在土壤中存活超过10年[2]，是棉花上的一种主要病害[3，4]，在中国的四大棉区都存在着较大的影响，目前尚未找到能够控制该病害发生的有效措施。

笔者在进行菌株的致病力测定时，从华中农业大学张献龙实验室得到了一株纯合的对照菌株V991，培养性状为黑色菌核型，致病力强。经过多次继代培养后，角变得到一株白色的菌株，为菌丝型，气生菌丝茂盛，经查氏培养基接种后致病力明显弱于V991，但其性状可以得到稳定的遗传。经过rDNA-ITS分子鉴定发现弱毒株和强毒株的DNA序列完全相同，但生物学特性及致病力完全不同。

由于大丽轮枝菌的变异性非常强，在常规的PDA培养基上极易发生变异，经过多次继代培养后，菌株的致病力也会发生减退。PDA培养基作为一种半合成培养基，用于产孢或扩繁菌种较适合，但不适于研究培养条件对菌株的影响。查氏培养液作为组分已知的一种培养基，常用于黄萎病菌的扩大培养，继而对鉴别寄主进行根部接种。真菌的生长需要钾，在丛生真菌中，缺钾和钾过量对真菌的生长都不利[5]。而且胞内K+的大量积累对维持有机体的正常功能至关重要，K+的丢失会导致多种代谢途径如糖酵解和呼吸作用等受阻[6]。查氏液体培养基中钾、钠含量和钾钠比（K+/Na+）是已知的，因此本试验通过调整其中的K+/Na+，对培养基组分进行改进，用于培养菌株，观察并记录其生理生化特性以及菌株的致病性，阐明培养基中K+、Na+及其比值变化对目的菌株的影响，以及它们与菌株致病性的关系，为病原菌的致病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

大丽轮枝菌菌株V991b（Vb），白色突变株V991w（Vw），由华中农业大学实验室提供；对照菌株Ay，由中国农业科学院棉花研究所提供。

1.2 不同培养基对大丽轮枝菌生物习性的影响

1.2.1 试验设置 试验设置以常规的查氏液体培养基为基础，钠盐和钾盐的用量及钾钠比见表1，其中无钠培养基CA6以等摩尔的硝酸钾代替硝酸钠；无钾培养基CA7以等摩尔的磷酸氢二钠代替磷酸氢二钾，以等摩尔的氯化钠代替氯化钾。其余成分均不变，分别为蔗糖30.00 g、硫酸镁0.50 g、硫酸亚铁0.02 g、琼脂15.00 g、去离子水1 000 mL。常规的查氏培养液的成分参见文献[6]，为减少沉淀将磷酸盐分别灭菌，冷却后在无菌条件下加入到培养基中[7]，其中K+/Na+为1.312∶1。

1.2.2 调查内容及方法 病原菌接种于PDA培养基上培养5 d，沿菌落外缘打孔，菌饼直径5 mm。再转接到不同K+/Na+ 的查氏固体培养基中，分别标记为CA1、CA2、CA3、CA4、CA5、CA6、CA7、CK，置于（25+1） ℃培养箱中黑暗静置培养，每隔1 d观察菌落生物学性状并用十字交叉法测量菌落直径。调查菌落质地、菌落形成特征、菌落颜色、色素有无、培养温度、培养基类型、测量时间和菌株生长速率，培养15 d后，结束调查。

1.3 不同培养基培养对大丽轮枝菌致病力影响的测定

1.3.1 接种病原菌的制备 参照“1.2.1”中的查氏培养基的成分，依次称重，将培养液100 mL装入250 mL三角瓶内，121 ℃、0.103 MPa条件下灭菌30 min。然后将在PDA平板中生长15 d的供试菌株用0.7 cm的打孔器打成菌碟，接入到查氏液体培养液中，在25 ℃黑暗条件下，120 r/min振荡培养15 d。

1.3.2 棉苗的致病力测定 种子经硫酸脱绒后，每个品种挑选饱满的棉种，播种前用70%的乙醇浸泡5 min，用5%的H2O2浸泡2 h，无菌水冲洗2～3遍。采用无土基质育苗技术育苗，将棉子播下[8]。保证苗床的湿度和温度，培养棉苗25 d至2～3片真叶时，即可接种。取每个品种60株棉苗，保持根部基本整齐一致，置于同一菌系的菌液中，使根充分接触菌液。裸苗浸根接种30 min，后移栽至营养钵中。在网室内放置最低最高温度表，记载每天的温度状况，均温26 ℃左右。观察和记录病害的发生情况，分别于15、20、25 d调查发病率及病情指数。

1.3.3 数据分析 采用DPS 5.0单因素方差分析和Duncans新复极差测验的多重比较分析试验数据。

2 結果与分析

2.1 不同处理条件下培养基对不同菌株生物学性状的影响

不同处理条件下，对病原菌的培养性状表型的影响如图1、图2所示。

由图1可知，Vb在低钾至高钾查氏固体培养基中均出现微菌核，但微菌核数量上有一定差异。从形态上看，无钾培养基上的菌落中的气生菌丝均匀分布于菌落表面，微菌核数量多，但生长受到了明显的抑制。不同钾钠比的查氏固体培养基上的Vb菌株气生菌丝明显减少，且菌丝非常稀疏，零星散布于菌落表面。

由图2可知，Vw在低钾至高钾查氏固体培养基上均无微菌核产生，气生菌丝在菌落表面均有分布，在不同钾钠比的查氏固体培养基上Vw菌株气生菌丝较短，且稀疏很多，仅在菌落表面产生很薄的一层菌丝。无钾条件下，Vw菌落生长抑制明显，几乎无气生菌丝，整个菌落呈膜状。

2.2 不同钾离子浓度对菌核型菌株微菌核数量的影响

由表2可知，K+浓度高低对微菌核的产生有影响，K+/Na+为5.248的固体培养基条件下，Vb的微菌核产量最大，整个菌落都呈黑色，且对菌株的生长无显著影响。无钾处理中，菌落中同样存在微菌核，但菌落直径明显低于其他处理，只相当于其他处理菌株生长直径的40%左右。说明在真菌生长过程中钾离子对真菌生长有较大影响，对微菌核的产生也有影响，但非必要影响因素，在K+/Na+为5.248的固体培养基条件下，K+浓度对微菌核产量的影响最大。

2.3 不同K+/Na+的查氏固体培养基对Vb显微结构的影响

不同K+/Na+的查氏固体培养基对Vb和Vw的形态学影响如图3所示，主要表现在气生菌丝的浓密稀疏程度及培养基上菌丝的数量和微菌核的数量上。但从低钾到高钾培养基，Vb均能产生微菌核，对分生孢子大小、菌丝的分隔和微菌核的微观结构影响不大；Vw的微观形态与常规PDA上无明显差异，但无钾培养基对真菌产孢量影响较大，产孢量明显下降，菌丝体含量也明显下降。

2.4 不同K+/Na+的查氏固体培养基对菌核型菌落产生微菌核时间的影响

由表3可知，25 ℃条件下，Vb在不同K+/Na+的查氏固体培养基上均能产生微菌核，CA1、CA2、CA3、CA5、CA7、CK的微菌核出现在接种后3 d，CA4与CA6的微菌核出现在接种后5 d，培养皿上均有明显的微菌核结构。30 ℃条件下，低K+/Na+固体培养基上未见微菌核结构，K+/Na+为20.992以上的固体培养基上有部分出现微菌核，但总体上微菌核较少。

2.5 不同K+/Na+的查氏固体培养基对菌落生长速率的影响

在25 ℃条件下，从不同K+/Na+ 的查氏固体培养基菌落生长速率（表4、图4）可以看出，菌落生长 7 d达到最快生长速率。平均生长速率约10 mm/d。CA7为无钾培养基。从菌落直径上看，无钾培养基上菌株生长速率显著低于其他培养基，说明在真菌生长过程中，无钾条件会显著影响菌株生长直径。

在30 ℃条件下，除无钾培养基CA7外，其他不同K+/Na+的查氏固体培养基的菌落生长速率无显著差异，可能是高温导致菌落的生长速度降低，使菌株之间的生长速率差异不显著。生长前期强弱毒株菌落的生长速率差异不明显，生长后期弱毒株Vw菌落生长速率高于强毒株Vb，说明Vw对高温的耐受力强于Vb。从接种2周的菌落生长速率曲线可以看出，生长前中期，Vb生长快于Vw，静置培养2周后，Vw生长速率反而高于Vb（表5、图5）。

2.6 不同K+/Na+查氏固体培养基对菌落直径的影响

静置培养15 d，不同K+/Na+查氏固体培养基上的菌落直径有一定的差异。对照CK查氏固体培养基上的菌落直径最大。在25 ℃条件下，高毒Vb菌株在低钾培养基与高钾培养基之间差异显著，高毒Vb和低毒Vw菌株均与无钾处理CA7差异极显著。高毒Vb和低毒Vw在25、30 ℃条件下，无钾处理CA7与其他处理间均差异极显著，说明无钾条件下，Na+能够明显抑制真菌的生长，而无钠条件下，K+能够基本满足真菌生长的需求，弥足Na+的缺失，使得真菌生长水平接近对照CK（表6、表7）。

2.7 不同K+/Na+查氏液体培养基摇菌后对菌株致病力的调查

在温室条件下，将棉苗分成3组，进行组间显著性比较。3种鉴别寄主15dpi、20dpi、25dpi的病指结果见表8。

由表8可知，与对照CK相比，当K+/Na+在较低水平时，随着K+浓度的上升，菌株的致病力有所增强，CA1处理中，强毒株Vb和弱毒株Vw的病指均高于对照CK的病指。当鉴别寄主接种25 dpi时，Vb-CA1的病指（63.35）高于Vb-CK的病指（57.14）；Vw-CA1的病指（25.51）与Vw-CK的病指（26.88）相当。当K+/Na+高于20以上时，菌株的致病力随着K+浓度的升高而增强。

无Na+处理中菌株的致病力有小幅度下降，Vb-CA6在鉴别寄主接种15 dpi、20 dpi和25 dpi时的病指依次为19.07、38.50、56.99，而Vb-CK的病指依次为13.99、40.62、57.14；Vw-CA6在鉴别寄主为15 dpi、20 dpi、25 dpi时的病指依次为2.13、7.81、16.86，而Vw-CK的病指依次为4.94、14.76、26.88。

无K+处理中菌株的致病力明显低于对照菌株，Vb-CA7在鉴别寄主为15 dpi、20 dpi、25 dpi时的病指依次为15.39、32.04、44.93，而Vw-CAT的病指依次为3.19、8.15和14.05，分别低于Vb-CK、Vw-CK。

在K+浓度不变的条件下，Na+与病原菌的致病力初步呈正相关，Na+浓度升高，K+/Na+降低，病原菌的致病力表现为上升，Vb-CA1在鉴别寄主为15 dpi、20 dpi、25 dpi时的病指分别为20.20、47.37、63.35，均高于Vb-CK；Vw-CA1在鉴别寄主为15 dpi、20 dpi、25 dpi时的病指分别为7.51、20.47、25.51，高于或近于Vw-CK；而当Na+浓度下降，K+/Na+比上升，病原菌的致病力表现为下降。在CA3与CA4处理中，Vb-CA3在鉴别寄主为25 dpi时的病指为58.82，明显高于Vb-CA4；Vw-CA3在鉴别寄主为25 dpi时的病指为28.02，高于Vw-CA4，但差异不显著。

3 小结与讨论

通过对不同K+/Na+查氏固体培养基对菌株生物学特性的研究，结果表明，不同K+/Na+培养条件对同一菌株的形态学无影响，但对同一菌株气生菌丝和微菌核的数量有影响。强毒株V991b的微菌核产量最大是在K+/Na+为5.248的查氏固体培养基上，并且高于对照CK，但在无K+条件下同样有微菌核的产生。说明K+浓度对微菌核的产生有一定影响，但非产生微菌核的必要影响因素，在K+浓度适中情况下会增加菌株微菌核的产量。

与25 ℃相比，30 ℃条件下不同培养基上微菌核数量有明显的下降，说明高温对微菌核的影响比培养基成分的影响更大。高温会抑制微菌核的产生，这与白应文等[9]对轮枝孢微菌核特性的研究一致。

无K+条件下，25、30 ℃处理下强毒株Vb和弱毒株Vw的生长明显受到抑制。培养皿的背面Vb中的微菌核明显可见，气生菌丝稀疏且均勻散布在菌落表面；Vw菌落表面几乎无气生菌丝，整个菌落呈膜状。说明在无K+条件下，Na+能够明显抑制真菌的生长，而无Na+条件下，K+能够基本满足真菌生长的需求，弥足Na+的缺失，使得真菌生长水平与对照CK基本相当。

与对照CK相比，当K+/Na+在较低水平时，随着K+浓度的上升，菌株的致病力有所增强，在CA1处理中，强毒株Vb和弱毒株Vw的病指均高于对照CK的病指。当K+/Na+高于20时，菌株的致病力依然会随着K+浓度的升高而增强。而无K+处理中菌株的致病力明显低于对照菌株，随着接种时间的延长，这种差异性更显著。

强毒和弱毒菌株造成致病力差异的原因有可能与菌株对鉴别寄主的侵染力或病原菌在植株体内的繁殖速度有关。通过不同营养来源的培养基对强毒和弱毒菌株进行致病力测定发现，使用常规查氏培养基摇菌后，病原菌的致病力最高，而以棉叶组织为营养来源的培养基摇得的菌株致病力最低，大部分植株均处于未发病状态。这可能与植物营养培养基对病原菌菌株进行了“减毒”有关，该现象已经在番茄上发现类似的表现[10]。但强弱菌株致病力差异究竟是由于病原菌的初侵染能力不同導致的，还是病原菌在植物体内的繁殖速度的不同导致的，还有待于进一步的验证。

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