湖北省主栽甘薯品种病毒种类的血清学检测

刘意++苏文瑾++雷剑++王连军++柴沙沙++杨新笋++张文英

摘要：对湖北省2个甘薯主产区内3个甘薯主栽品种，共计39份样本甘薯病毒病采用硝酸纤维膜酶联免疫检测法（NCM-ELISA）检测。结果表明，39份测试甘薯样本中，1个样本感染了甘薯退绿病毒（SPCFV），检出率为2.56%；18个样本感染了甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV），检出率为46.15%；4个样本感染了甘薯潜隐病毒（SPLV），检出率为10.26%；1个样本感染了甘薯G病毒（SPVG），检出率为2.56%。3个主栽甘薯品种中，鄂薯6号病毒检出率最高，为66.67%；其次为徐薯22，病毒检出率为45.45%；福薯18的病毒检出率为43.75%。不同产地甘薯主栽品种带毒状况调查表明，鄂州主产区病毒病种类最多，病毒检出率最高。在5种受测目标病毒中，SPFMV的发生和危害最为严重，其单个采样点的样本感染率最高为52.12%；其次为SPLV，单个采样点的样本感染率为20.00%。2个主产区检测样品均未检测到甘薯退绿矮化病毒（SPCSV），但并不意味SPCSV在2个主产区没有发生，因此有待进一步大范围调查验证。

关键词：甘薯；病毒病；硝酸纤维膜酶联免疫检测法（NCM-ELISA）

中图分类号：S435.313 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5821-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.023

Identification of Virus Diseases in Main Sweetpotato Cultivars in Hubei Province

LIU Yi1，SU Wen-jin2，LEI Jian2，WANG Lian-jun2，CHAI Sha-sha2，YANG Xin-sun2，ZHANG Wen-ying1

（1.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China；2.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement/Hubei Sweetpotato Engineering and Technology Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： Thirty-nine samples of three sweetpotato cultivars collected from two major producing areas in Hubei province were tested by NCM-ELISA method. The results showed that among all the samples， one sample infected SPCFV and the other one infected SPVG， disease detection rate of them was 2.56%， respectively； Eighteen samples infected SPFMV， detection rate was 46.15%； Four samples infected SPLV， detection rate was 10.26%. Eshu No.6 got the highest detection rate， which was 66.67%； The detection rate of Xushu No.22 and Fushu No.18 was 45.45% and 43.75%， respectively. The sanitary state investigation showed the cultivars in Ezhou infected more kinds of virus diseases than in Wuhan. Among all the tested virus diseases， SPFMV was the most popular kind of disease，sample infection rate in one collection area was 52.12%； The following virus disease was SPLV，sample infection rate in one collection area was 20.00%. Neither of the two areas detected sample had found SPCSV，but it wasnt meaned that SPCSV didnt happen in two areas， so we need further large-scale survey.

Key words： sweetpotato； virus disease； NCM-ELISA

甘薯是中國重要的粮食与经济作物，其产品已经延伸到食品、能源等各个领域[1]。甘薯作为湖北省主要的杂粮作物，种植面积占全省耕地总面积的5%～6%，同时由于湖北省位于国内南北两大甘薯种植优势区的交叉地带，常年种植面积位居全国前十，产业发展快速。近年来，各个甘薯种植新区相继建立，甘薯栽培面积不断扩大，各地区间引种日益频繁，导致了甘薯病毒病危害更为严重，已成为制约甘薯产业发展的重要因素。甘薯病毒病往往采取复合侵染的方式进行危害，繁多的病毒种类给病毒病防治带来了很大的困难，通常根据种植季节的不同，甘薯病毒病侵染可以造成30%～50%不等的损失[2]，甘薯病毒病造成的甘薯品质下降和种性退化给农业生产造成巨大损失[3，4]。为了减少甘薯病毒病的传播与蔓延，特别是一些危险性病毒病的传播与侵染，对一些主栽甘薯品种进行病毒检测显得十分重要。目前，甘薯病毒病检测的方法有多种，包括症状学检测、指示植物检测、电子显微镜检测、双链RNA分析、核酸斑点杂交以及血清学检测等[5]。其中血清学检测是目前国内外最常用的甘薯病毒病检测方法之一[6，7]。血清学检测法包括免疫电镜法（ISEM）、双抗体夹心酶联免疫检测法（DAS-ELISA）、硝酸纤维膜酶联免疫检测法（NCM-ELISA）等，其中NCM-ELISA法以灵敏度高、重复性好逐步取代了DAS-ELISA法被应用于甘薯病毒病检测[8]。

从世界各地的统计结果看，甘薯病毒病的种类有10种之多[9]。本试验采用NCM-ELISA法对湖北省内甘薯主栽品种病毒种类进行检测，旨在弄清楚相关病毒在湖北省甘薯主产区的流行趋势，为建立湖北省甘薯脱毒苗繁育技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试材料来自武汉和鄂州两个甘薯主产区。2014年8月上旬，在湖北省农业科学院粮食作物研究所试验基地（武汉）、江夏试验基地（武汉）以及鄂州农户自留田中随机摘取福薯18、徐薯22、鄂薯6号3个品种具有一定症状的植株上、中、下3部分的新鲜叶片，将样品密封于样品袋中，注明采集日期、地点、品种，于4 ℃冰箱中备用。参试材料中包含11份徐薯22样品，均采自农户自留田；12份鄂薯6号样品，均采自农户自留田；16份福薯18样品，其中6份采自湖北省农业科学院粮食作物研究所试验基地，10份采自江夏试验基地。

1.2 测试病毒种类及病毒检测方法

甘薯病毒病抗血清由河南省农业科学院提供，本研究采用邢继英等[2]的甘薯病毒病检测方法分别对甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯退绿病毒（SPCFV）、甘薯退绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）进行检测，以下简称SPFMV、SPLV、SPCFV、SPCSV、SPVG。

2 结果与分析

2.1 主栽甘薯品种田间症状调查及血清学检测

对来自武汉和鄂州的39份甘薯主栽品种样品进行了病毒病检测，5种病毒病检测统计结果见表1、图1～图5。结果表明，在检测的39份甘薯样品中，SPFMV、SPLV、SPCFV、SPVG、SPCSV 5种甘薯病毒，SPCSV的检出率为0，SPCFV、SPFMV、SPLV、SPVG的检出率分别为2.56%、46.15%、10.26%、2.56%，即4种病毒均有发生，其中，SPFMV的检出率最高。

2.2 不同主栽甘薯品种病毒感染状况

3个甘薯主栽品种徐薯22、鄂薯6号、福薯18检测出至少携带2种目标病毒（表2），在检测的目标病毒中，SPFMV发生最为普遍，3个测试甘薯品种中均携带该病毒，没有品种感染SPCSV，SPCFV只在徐薯22中被检测到，SPLV在鄂薯6号和福薯18中均被检测到，SPVG在鄂薯6号中被检测到。在被测的3个甘薯品种中，徐薯22的病毒检出率为45.45%，鄂薯6号的病毒检出率为66.67%，福薯18的病毒检出率为43.75%。

2.3 不同产地甘薯主栽品种带毒状况

在2个甘薯主产区采样分析后发现，不同产地甘薯品种间病毒检出率存在较大差异。表3结果显示，SPFMV是鄂州和武汉两地均存在的病毒。在鄂州采集的样品中，SPFMV的检出率达到52.17%，另外还有少量的品种带有SPCFV、SPLV和SPVG，病毒检出率分别为4.35%、8.70%和4.35%。在粮食作物研究所试验基地采集的样品中，SPFMV的检出率达到50.00%，未见感染其他病毒。在江夏试验基地采集的样品中，SPFMV的检出率达到30.00%，同时SPLV的感染率达到20.00%，尚未见感染其他病毒。

3 小结与讨论

3.1 甘薯病毒病检测研究进展

甘薯病毒病检测可以分为症状学诊断、生物学检测、血清学检测以及各种分子检测等。症状学诊断常受病毒种类、品种类型、生长阶段以及环境条件等因素影响，因此症状学诊断只能作初步判断。生物学检测又叫指示植物检测法，指示植物对某一种或某几种病毒具有敏感反应，一旦被感染，就能表现出症状，但是往往存在一病多症、多病一症的现象，难以区分病毒种类，另外通过指示植物进行病毒病检测周期长且占地面积大，不利于大批量检测[10]。

血清学检测是最常用和有效的植物病毒检测方法之一，在甘薯病毒检测方面，Moyer等[11]首次纯化了SPFMV；张振臣等[12]、付振艳等[13]、黄玉娜等[14]、张业辉等[15]分别在大肠杆菌中高效表达了SPFMV、SPVG、SPLV、SPVMV的CP基因，通过纯化蛋白、免疫家兔制备了上述病毒的抗血清。NCM-ELISA以硝酸纤维素膜（NCM）为固相载体，使得检测更为简便、快速、经济。Abad等[16]用NCM-ELISA法检测了SPFMV及其不同株系。Karyeija等[17]用NCM-ELIS法对SPFMV进行研究；Brunt等[18]用NCM-ELISA法对SPLV进行了研究，张立明等[19]用NCM-ELISA法对黄淮薯区1 580份甘薯样品进行测定，表明SPFMV和SPLV是普遍存在的两种主要甘薯病毒。单林娜等[20]采用NCM-ELISA法检测南阳市甘薯病毒病，表明南阳市甘薯病毒主要为SPFMV、SPLV、SPCFV、SPMMV等。喬奇等[21]采用NCM-ELISA法，对中国18个省市176份表现甘薯病毒病症状的样品进行检测，结果表明，供试样品中SPFMV的阳性率最高，达56.30%，并发现中国甘薯至少存在SPFMV、SPVG、SPLV、SPCFV、SPCSV、SPCMV、SPVMV和SPLCV 8种病毒，与本试验的研究结果趋于一致。

3.2 湖北省甘薯病毒病发生分布

本试验初步研究了湖北省主要甘薯病毒病发生的种类和分布特点以及湖北省甘薯主栽品种的病毒病感染状况。SPFMV是2大甘薯主产区鄂州和武汉发生最为普遍的病毒种类，在被测试的所有甘薯样本中，SPFMV检出率为46.15%。在3个不同的种植区域，SPFMV的检出率分别达到52.17%、50.00%和30.00%。通常在一个特定的甘薯产区中，一个品种的单株感病，该品种其他的单株都被同一种病毒感染，本研究认为品种的频繁引进与输出是病毒病传播的主要途径，这与王明霞等[10]的研究报道一致。

鄂州与武汉两地大约在6～7月出现肉眼可见的染病单株症状，主要表现为明脉、退绿、生长停滞。徐薯22、鄂薯6号、福薯18均是湖北省主栽甘薯品种，在3个种植区域的样本中均检测到了SPFMV。根据血清学检测结果，除了SPFMV外，其他病毒也有进一步蔓延的趋势。如SPLV检出率为10.26%，SPCFV和SPVG的检出率均为2.56%，对一些品种进行田间调查时，肉眼看不出任何症状，但是血清学检测结果说明该品种已带有病毒，目前表现为隐性。另外，目前全国SPVD大暴发，传染力极强，SPVD的发生依赖于SPCSV和SPFMV的协同传播，SPFMV通常能迅速传播到感染SPCSV的植株上，有SPCSV最初症状的甘薯很快能形成SPVD[22]，在本研究所调查区域的样品中并未发现SPCSV，但是SPFMV检出率高，更应警惕SPVD在湖北的暴发。湖北省2个甘薯主产区武汉和鄂州均检测到甘薯病毒病的发生，其中SPFMV在两地发生最严重；主栽品种中鄂薯6病毒检出率最高；2个主产区中，鄂州农户自留田病毒病种类最多，病毒检出率最高；2个主产区的检测样品均未检测到甘薯SPCSV，但并不意味着SPCSV在2个主产区没有发生，有待进一步大范围调查验证。试验结果表明，甘薯病毒病在湖北呈现多样性暴发趋势，应加强甘薯病毒病的检测和预防工作。

由于本试验所采集的样品主要来自湖北重要的甘薯品种试验基地，具有一定的代表性，因此调查结果对湖北省甘薯病毒病的防治奠定了基础。但是，由于NCM-ELISA方法常存在假阳性反应，使得检测结果具有一定的误差，因此其真实性还需进一步验证，加快RT-PCR等快速、有效的分子水平检测方法的建立，以适应现代科研及生产的需要尤为重要[1，23]。

3.3 甘薯病毒病的防治

甘薯病毒病发生可以通过多种途径，已知的甘薯病毒病都可以通过块根和嫁接传播，还可以通过菟丝子、粉虱以及牵牛或野生烟草的种子进行传播[20]，其寄主的种类也十分复杂多样，尤其喜好寄生在牵牛属植物上[11]。甘薯病毒病的发生和流行程度往往取决于种薯、种苗带毒率和各种传毒介体种群数量、活力以及品种抗性，此外还与土壤、耕作制度和栽植期有关。因此，甘薯病毒病的防治可采取农业防治的方法，如保持田间清洁、去除菟丝子或其他牵牛属植物类田间杂草、避免与牵牛属作物进行间作以及采用轮作的方式以阻断病害的循环。此外，对蚜虫、粉虱等病毒传播媒介进行有效控制也可减轻甘薯病毒的传播。但大量化学药剂的使用虽然杀死了蚜虫、粉虱等病毒传播介体，却污染了环境。截至目前为止，防治甘薯病毒病的最好方法是用组织培养的方法培育脱毒甘薯苗，配套良好的耕作栽培制度，提高病毒病检测和预防效率[24，25]，综合以上措施可以达到控制甘薯病毒病进一步蔓延的目的。

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