基于ITS条形码序列的枸杞属植物鉴定

石志刚++万如++李彦龙++王亚军

摘要：采用改进CTAB法提取枸杞（Lycium Chinense Mill.）叶片DNA，利用合成的特异引物对其DNA中nrDNA ITS区进行扩增，利用ITS条形码序列，对枸杞属种质资源进行鉴定，分析其亲缘关系。结果表明，测序得到了17份枸杞属近缘种的ITS条形码序列，整个ITS序列长度变异范围为603～632 bp，平均为624 bp，整个转录间隔区（ITS1+ITS2）对位排列后总长度为480 bp，有194个变异位点，占40%；保守位点288个，占60%。聚类分析结果表明，17份种质资源可分为5个大类群。基于ITS条形码序列分析在鉴定枸杞属种质遗传多样性及其亲缘关系具有一定的优越性。

关键词：枸杞属（Lycium L.）；ITS序列；DNA测序；鉴定

中图分类号：S567.1+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5966-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.059

Identification of Lycium L. Germplasm Resources Based on nrDNA ITS Sequence

SHI Zhi-gang，WAN Ru，LI Yan-long，WANG Ya-jun

（Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan 750002，China）

Abstract：Adopting improved CTAB to acquire DNA of leaf of Lycium Chinense Mill.，and making use of composite special primers to propagate and clone nrDNA ITS area of DNA，and then sequencing analysis of the target segment. To identify genetic diversity of Lycium L. germplasm resources by the nrDNA ITS sequence. The results showed that the nrDNA ITS sequence of 17 Lycium L. was gained for the first time；the variation length of the whole ITS sequence was 603 to 632 bp，and the average was 624 bp； the total length of whole transcribe partition area（ITS1 and ITS2） sequence alignmentwas 480 bp，and there were 194 variable sites accounting for 40.4%， and 286 conserved sitesaccounting for 59.6%. Based on the nrDNA ITS sequence analysis of 17 Lycium L. germplasm resources，it was obvious that they could be divided into 5 groups. The nrDNA ITS sequence analysis is a advantageous way to study genetic diversity among Lycium L. germplasm resources.

Key words：Lycium L.； Internal transcribed spacer； measure the sequence of DNA； identification

枸杞（Lycium Chinense Mill.）屬于茄科（Solanaceae）族（Solaneae Reichb.）枸杞属（Lycium L.），枸杞属植物在全球的分布约有80种，多分布于南、北美洲，以美国亚利桑那州和阿根廷形成两个分布中心；欧亚大陆约10余种。中国多数种类分布于西北与华北，中国分布的枸杞属有7种3变种[1]，宁夏农林科学院建成世界惟一的枸杞种质资源圃，保存了国内外分布的7种3变种2 000余份、近2万余株枸杞种质资源。收集保存的枸杞属种质资源种类繁多，传统的单纯依靠形态学的方法难以做出精确鉴别。由于ITS序列进化快，能更精确地对枸杞资源进行遗传分析，近年来被广泛用于种间或种内遗传多样性和系统发育关系分析[2]。本研究以保存于宁夏枸杞种质资源圃的17份枸杞种质资源为试材，利用ITS条形码序列，对枸杞属种质资源进行鉴定，分析其亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以收集保存在宁夏农林科学院枸杞中心枸杞种质资源圃内的17份枸杞属种质资源为试材，其中，美国枸杞为从美国收集到的枸杞属种质资源，韩国枸杞为从韩国收集到的枸杞属种质资源，其余为中国分布的枸杞种质资源，具体见表1。

1.2 试验方法

采用CTAB法[3，4]进行DNA提取方法。依据GenBank数据库中已发表的茄科植物nrDNA ITS序列，设计如下引物：P1：5′-AACCTGCGGAAGGATCATTGTC-3′，P2：5′-TGATATGCTTAAACTCAG CGGGTA-3′，以上述引物对17个供试材料的基因组DNA基因PCR扩增，扩增体系为：2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+），0.5 μL dNTPs，P1和P2（20 μmol/L）各1 μL，Taq酶1.5 U，模板DNA 50 ng，加ddH2O补足至25 μL。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度可在58～60 ℃之间调节），72 ℃延伸45 s，36个循环；72 ℃保温7 min；4 ℃保存。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒（购于北京博大生物技术有限公司产品）对约650 bp的目标条带进行回收。将回收产物连接于T载体（pGEM-T），转入大肠杆菌，采用蓝白斑法筛选阳性菌落。对阳性菌落进行PCR检测后送往北京奥科公司和北京六合通经贸有限公司测序。

1.3 17份枸杞属种质资源发育进化树的构建

采用MEGA4.0分析软件对17份ITS测序结果构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 枸杞属17份种质资源ITS区序列长度和变异信息

国产枸杞属不同种植物中，整个ITS序列长度变异范围为603～632 bp，平均为624 bp。整个ITS1序列长度变异范围为225～253 bp，平均为247 bp。整个5.8S nrDNA序列长度变异范围都为154 bp。整个ITS2序列长度变异范围为207～225 bp，平均为223 bp。整个ITS区排序后的总长度为634 bp，其中ITS1，5.8S和ITS2排序后的长度分别为255、154和225 bp。将gap（空位）作missing（缺失）处理时，由于5.8S nrDNA序列过于保守，不适于用作系统发育分析，因而在本研究中利用ITS1和ITS2区序列进行统计发育分析。整个转录间隔区（ITS1+ITS2）对位排列后总长度为480 bp，共有192个变异位点，变异位点分别为103和89个，占40.0%；保守位点288，占60.0%；有43个信息位点，占9.0%，105个转换位点，58个颠换位点，其中ITS1区的信息位点所占比例略高于ITS2区，而ITS2区的转换/颠换比值高于ITS1区。17种枸杞属种质资源ITS序列特征如表2所示。

2.2 枸杞属17份种质资源亲缘关系分析

对枸杞属17份种质资源的ITS区碱基序列进行聚类分析，结果如图1所示。从聚类图中可以看出，枸杞属17份种质资源的亲缘关系与差异，明显的分为5个大类群：第一类群，以“宁杞1号”为代表的宁夏枸杞与截萼枸杞、柱筒枸杞、紫柄枸杞、北方枸杞变种构成亲缘关系较近的一支；第二类群，“黑果枸杞”和中宁黑果、青海黑果、黄果枸杞变种构成一支；第三类群，中国枸杞自成一支。第四类群，新疆枸杞、红枝枸杞变种、韩国枸杞、蔓生枸杞、云南枸杞、常熟枸杞等构成亲缘关系较近的一支；第五类群，美国枸杞自成一支。通过ITS条形码序列能将不同亲缘关系的枸杞属近缘种种质资源区分开来。

3 小结与讨论

3.1 17份枸杞属种质资源的遗传多样性

由于17份种质同属于枸杞属近缘种，在遗传多样性鉴定评价过程中，植物学或农艺性状易受环境和栽培措施的影响不易鉴别，同时细胞学性状多态性不丰富，同工酶性状有器官特异性且受生长发育阶段的影响，具有一定的局限性。分子标记方法的出现，为资源鉴定评价提供了新的方法，本研究利用真核细胞中18S、5.8S、28S RNA基因的保守区序列，设计PCR引物成功扩增出整个ITS区，并完成了扩增产物的DNA碱基序列的测定，得到17份枸杞属近缘枸杞种ITS区的完整序列，基于ITS序列分析得出17份种质整个转录间隔区（ITS1+ITS2）对位排列后总长度为480 bp，共有192个变异位点，占40.0%，在遗传多态性检测中较形态学标记、同工酶标记表现出一定的优越性，同时根据聚类图17份种质分为5个大类群，可以较为清晰地看出种间的亲缘关系。从聚类图中可以看出，各分支内部具有较高的自展支持率，表明依据ITS序列差异对枸杞属下类群的划分，可以较好地支持依形态进行的属内类群的划分，但是属内各分支间的关系与传统的依形态特征确定的关系存在较大的差异。枸杞属的起源，根据聚类图说明，采自美国的种质材料与中国枸杞属的ITS序列差异最为明显，由于材料数量的限制，初步认为中国分布的枸杞属不同种与美国分布的枸杞属种质基于ITS序列分析，亲缘关系较远，自展支持率60%，形成各自独特的起源和分布中心。

3.2 17份枸杞属种质资源的亲缘关系

由于枸杞属种质资源较为丰富、起源驯化途径多样、栽培历史悠久、属内种间（渗透）杂交现象普遍，且地方品种本身并无科学名，导致品种资源不仅类型多而且名称乱，因此有必要开展枸杞种质资源的鉴定评价。基于ITS序列研究表明，基于ITS序列差异划分黑果枸杞与其他种属于不同分支，与其依果实颜色形态进行的属内类群的划分基本一致，而且采自不同地域（青海省、宁夏中宁、宁夏银川）的黑果枸杞聚在一起，说明ITS对于不同种的划分是有效的。基于ITS序列差异将采自常熟、蔓生、云南、韩国的枸杞聚在一起，与其他种属于不同分支，与其依树体和枝条形态进行的属内类群的划分基本一致。

参考文献：

[1] 马德滋，刘惠兰.宁夏植物志（第二卷）[M].银川：宁夏人民出版社，1990.

[2] 汪小全，洪德元.植物分子系統学近五年的研究进展概况[J].植物分类学报，1997，35（5）：465-480.

[3] CHENG K T，CHANG H C，HUANG H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin，2000，41（1）：11-14.

[4] SHI Z G，WEI A N，FAN Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J].Agricultural Science and Technology，2008， 36（16）：6686-6687.