ABA对低温胁迫下水稻幼苗抗氧化酶活性的影响

齐光+佟伟霜+杨雨华+陈明辉+吴秀菊

摘要：以耐冷型水稻（Oryza sativa L.）品种东农418和冷敏感型水稻品种松粳9号为材料，在三叶期以脱落酸（ABA）及其合成抑制剂钨酸钠进行喷施处理，通过抗氧化酶活性的响应，探讨低温胁迫下ABA对水稻苗期耐冷性的调节作用。结果表明，低温处理使叶片SOD活性降低，POD活性和MDA含量升高；外施ABA减缓了叶片SOD活性的降低，并可减少POD活性和MDA含量升高的幅度，而钨酸钠处理则加剧了SOD活性降低及POD活性和MDA含量的升高，说明ABA提高了水稻幼苗耐冷性。低温胁迫以及ABA对水稻抗氧化酶活性的影响因品种而异，外施ABA对耐冷型品种的调节作用效果更明显。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；耐冷性；脱落酸（ABA）；钨酸钠；抗氧化酶

中图分类号：S511；Q945.78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6079-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.017

Abstract： The rice varieties with different cold-tolerance（cold-tolerant variey Dongnong 418 and cold-sensitive variey Songjing 9） were treated with abscisic acid （ABA） and tungstate （inhibitor of ABA biosynthesis） at the stage of three leaves. The effects of ABA on antioxidase activity under low temperature stress were studied. The results showed that， compared with normal temperature control， the activity of superoxide dismutase（SOD） in rice seedling leaves decreased under the low temperature stress， in the meanwhile， peroxidase（POD） activity and malondialdehyde （MDA） content increased significantly. Exogenous ABA could effectively enhance the cold-tolerance abilities of rice seedlings under low temperature stress by slowing down the decrease of SOD activity and the increase of POD activity and MDA content. On the contrary， tungstate significantly accelerated the decrease of SOD activity and the increase of POD activity and MDA content. Generally， the effects of low temperature stress and ABA varied with different rice varieties， exogenous ABA was more effective on cold-tolerance varieties than cold-sensitive varieties.

Key words： rice（Oryza.sativa L.）； cold tolerance； abscisic acid； tungstate；antioxidase

全世界10%以上的稻作面积受到低温威胁[1]，黑龙江省年平均气温在-5～5 ℃，水稻（Oryza sativa L.）苗期受冷害影响严重，且苗期耐冷性与芽期、分蘖期、开花期和成熟期耐冷性呈显著正相关[2-5]，因此增强水稻幼苗耐冷性是高纬、高寒地区育种工作的重要目标[6]。

低温胁迫下植物代谢过程产生活性氧[7]，活性氧大量积累会引发膜脂过氧化，產生丙二醛（MDA）使生物膜受损加剧[8，9]，进而引发一系列生理失调。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是植物细胞中重要的抗氧化防护酶，其含量是常用的胁迫耐受性生理指标[10-12]。脱落酸（ABA）可以提高水稻[13，14]、小麦[15]、番茄[16]、甘蔗[17]等作物的耐冷性和产量，且对耐冷性强的品种效果更加明显[14，16]。目前有关ABA对水稻苗期耐冷性影响的研究主要是探讨内、外源ABA引起稻苗某些生理指标、冷胁迫蛋白、ABA响应元件以及内源激素的变化[12-14]，少有ABA及其合成抑制剂钨酸钠对不同耐冷能力水稻幼苗生长生理影响的对比研究。本研究通过外施ABA及钨酸钠，采用连续测定法探讨冷胁迫下不同品种水稻叶片SOD、POD活性和MDA含量的变化，以及ABA对冷胁迫下稻苗上述生理指标的调节作用，以进一步探讨ABA对水稻苗期耐冷性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料选取黑龙江省2个耐冷性差异较大的主栽水稻品种，即苗期强耐冷型品种东农418和苗期冷敏感型品种松粳9号。

1.2 试验设计

挑选饱满的水稻种子经浸种、催芽后，播种到装有蛭石的塑料杯中，置于光照培养箱中进行培养，设置光照度4 000 lx，昼/夜温度为28 ℃/24 ℃，每天光照时间为12 h，全程采用国际水稻所（IRRI） 营养液配方。二叶一心时清除弱苗，留下长势一致的幼苗。三叶期时进行如下处理：降温至15 ℃停留1 d，降温至8 ℃冷胁迫7 d，升温至15 ℃停留1 d，升温至25 ℃恢复生长。恢复生长4 d后调查叶片失绿度、叶片萎蔫度、叶片卷曲度和死苗率[2]。

于三叶期分别喷施400 mmol/L ABA和5 mmol/L钨酸钠（该浓度钨酸纳可抑制植物内源ABA的合成[18]），以喷施蒸馏水为对照。28 ℃光照培养箱中培养24 h后，将材料置于10 ℃/6 ℃（昼/夜）光照培养箱中进行低温处理，其中喷施蒸馏水的部分材料置于室温中（CK1），另一部分与ABA和钨酸钠处理进行相同的低温处理（CK2）。在低温处理的0、1、3、5、7 d对各处理组样品取相同部位叶片测定其生理指标。

1.3 测定方法

分别采用氮蓝四唑（NBT）光还原法和愈创木酚法测定SOD和POD活性，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法[19]。

2 结果与分析

2.1 冷胁迫下不同水稻品种4种耐冷性指标差异

叶片失绿度（1～9级）、叶片萎蔫度（1～5级）、叶片卷曲度（1～6级）和死苗率（1～9级）等指标可以直观地反映水稻品种的低温耐受性水平，且级数越高说明胁迫伤害越严重。前期以黑龙江省116份水稻品种进行苗期耐冷性鉴定，发现东农418的4个耐冷性指标都处于耐冷型品种范畴，而松粳9号则为冷敏感型品种（表1）。东农418和松粳9号在死苗率、叶片卷曲度和叶片失绿度等3个指标差异最为明显，叶片萎蔫度差异相对较小。

2.2 ABA对冷胁迫下不同水稻品种幼苗叶片SOD活性的影响

SOD活性与植物多种抗逆性密切相关，是植物体内重要的抗氧化防护酶[20，21]。由图1可知，冷处理1 d时，同一品种CK2、钨酸钠和ABA各处理组SOD活性略有升高，其中升幅最大的为ABA处理组。除CK1外，冷胁迫3 d后各处理组SOD活性均呈下降趋势，其中钨酸钠处理组降幅最大，而ABA处理则减缓了叶片SOD活性的降低。

对比两品种结果发现，ABA处理使苗期强耐冷型品种东农418幼苗叶片一直保持较高的SOD活性，甚至处理7 d时还与CK1相当；而苗期冷敏感型品种松粳9号SOD活性7 d时比CK1降低了13%。钨酸钠处理组SOD活性除处理1 d时略高外，其余各时间段都小于其他处理组。总体而言，钨酸钠处理加剧了SOD活性的降低，而且钨酸钠处理组东农418的SOD活性降低幅度小于松粳9号。

2.3 ABA对冷胁迫下不同水稻品种幼苗叶片POD活性的影响

POD与SOD有所不同，为非特异性过氧化物酶，同时担当着诱导产生H2O2和氧自由基以及清除H2O2的双重角色[22]。本研究两品种POD活性变化趋势存在差异。与CK1的POD活性相比，东农418低温胁迫各时段CK2和ABA处理组POD活性总体呈上升趋势；而钨酸钠处理组则在低温处理初期呈现POD活性上升趋势，在处理5 d时活性降低，随后又开始升高；与CK2相比，外源ABA可以显著减缓东农418叶片POD活性的增加。而松粳9号CK2处理组的POD活性在低温处理1～3 d时升高，之后又逐渐下降，钨酸钠和ABA处理组则是先升高后降低，最后又持续升高（图2）。

对比两品种ABA处理组可知，外施ABA使冷胁迫下东农418的POD活性长期处于较低水平，直到处理7 d时才大幅升高。松粳9号ABA处理组POD活性平均值高于农418，外施ABA减缓冷胁迫下POD活性升高的效果对松粳9号相对较弱（图2）。

2.4 ABA对冷胁迫下不同水稻品种幼苗叶片MDA含量的影响

MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物，MDA含量能够直观反映环境胁迫对植物细胞的伤害程度，是常用的环境胁迫生理指标[8，9]。由图3可知，两品种CK2、钨酸钠和ABA处理组MDA含量呈总体上升的趋势，不同点在于东农418的钨酸钠和蒸馏水处理组MDA含量在冷胁迫1 d时略有降低，随后又大幅升高，ABA处理组MDA含量则在1 d后缓慢升高。松粳9号钨酸钠和蒸馏水处理组的MDA含量在冷胁迫1 d时大幅升高，ABA处理MDA含量则在1 d时略有下降，随后又逐渐升高。

对比可见，冷胁迫处理7 d时两品种钨酸钠处理组MDA含量分别比0 d时增加了2.0和3.6倍。外施ABA可减缓MDA含量的增加，冷胁迫7 d时两品种ABA处理组的MDA含量虽然比CK1分别升高了26.0%和97.3%，但是比CK2分别降低了40.6%和10.8%。冷胁迫持续的7 d内东农418 ABA处理组MDA含量增幅都小于松粳9号，说明外施ABA处理减缓MDA积累的效果对苗期耐冷型品种更显著。

3 讨论

抗氧化酶是植物活性氧自由基清除系统中的重要酶类，可以平衡活性氧自由基的产生与清除过程[23]。MDA含量可在一定程度上反映植物细胞膜脂过氧化水平和对细胞膜结构的伤害程度。目前已有关于渗透、盐、低温等逆境胁迫下水稻抗氧化酶活性变化的研究报道，部分研究通过进一步测定内源ABA含量肯定了ABA提高水稻抗逆性的作用[12，14]，但是这类研究还欠缺同一试验中抑制内源ABA和施加外源ABA两种处理的对比研究。本研究设置了冷胁迫下蒸馏水、ABA合成抑制剂（钨酸钠）和外源ABA 3种处理，以室温下的蒸馏水处理为对照，对比耐冷型和冷敏感型品种抗氧化酶活性和MDA含量变化，更有助于揭示ABA提高水稻耐冷性的作用效果。研究結果显示，冷胁迫1 d时蒸馏水处理组水稻SOD活性和MDA含量都出现升高，这与干旱胁迫下抗氧化酶活性和MDA含量随胁迫加剧而升高的结果相符[24，25]。植物从感知逆境胁迫信号到产生生理调节或适应，经历了由基因、蛋白质（酶）、代谢、功能等各个环节构成的一系列生理过程[26，27]，逆境生理指标变化在时间上并不总是与逆境胁迫强度保持同步，已有研究表明高温胁迫下稻苗叶片SOD活性在处理1 d时升高，以后又逐渐降低[28]，而低温处理的水稻剑叶SOD活性也出现先升高后降低的趋势[12]，这与本研究低温胁迫下两品种3个处理组SOD活性变化趋势相同。处理1 d后SOD活性逐渐降低表明，由于抗氧化酶对胁迫处理在时间上的滞后性，被诱导升高的SOD活性只能减缓而不能阻止冷胁迫对叶片造成的伤害。

对比3个处理组可见，外施ABA处理组冷胁迫下水稻叶片SOD活性和MDA含量的变化幅度明显小于蒸馏水（CK2）和钨酸钠处理组，这与汤日圣等[28]外施ABA减小高温胁迫下SOD活性和MDA含量的变化幅度结果类似。本研究结果表明外源ABA能有效减缓长期冷胁迫下水稻叶片SOD活性的降低和MDA的积累，对维持水稻叶片细胞正常结构和功能起到重要作用。对比两品种可见外源ABA对SOD活性和MDA含量的调节具有品种差异性，对耐冷型品种东农418效果更加明显，而冷敏感型品种松粳9号外施ABA的效果持续时间相对较短。本研究ABA对水稻苗期耐冷性调节的品种差异性与以往研究中对西红柿、小麦和大豆等作物耐冷性研究的结果相符[16，29，30]，差异产生的信号转导及分子机理有待于进一步探讨。ABA合成抑制剂钨酸钠能抑制叶片内源ABA合成，导致水稻叶片受到比蒸馏水对照组（CK2）更严重的伤害。刘春玲等[14]研究了水稻多重耐性与ABA的关系，发现耐型品种在逆境胁迫下积累的ABA量比敏感型品种高，ABA积累时间也更长。对比两品种钨酸钠处理组可见，冷胁迫下东农418 SOD活性降低和MDA含量升高幅度都小于松粳9号，推断试验过程中耐冷型品种东农418内源ABA含量比冷敏感型品种松粳9号更高。

POD是一类非特异性过氧化物酶，同时担当着诱导植物细胞产生氧自由基和H2O2以及清除细胞H2O2的双重角色，而H2O2又同时起着ABA信号分子和氧化剂的双重作用，POD及其作用底物H2O2的双重身份造成POD活性会因试验条件和所担当的具体角色而变化[22，31]。本试验中两品种部分处理组（尤其是钨酸钠处理组）POD活性出现先升高再降低最后又升高的现象，可能就是POD酶角色发生转变的结果，其转变的具体机制有待于今后研究中继续探讨。本试验钨酸纳处理组POD活性在冷胁迫下发生明显的先升高再降低最后又升高的趋势，但是不同品种发生转折的时间点不同，耐冷型品种东农418变化较迟钝，冷敏感型品种松粳9则变化迅速。最初的增加表明POD作为抗氧化酶起到缓解冷胁迫伤害的作用，转折点暗示POD的作用发生逆转并导致对植株的伤害，并且随着冷胁迫的持续，POD不断释放，伤害会逐步加深。以往研究发现低温胁迫下强抗寒力的冬小麦品种POD活性低于抗寒力差的品种，这是因为强抗寒力品种的低POD活性可以抑制氧自由基和H2O2的产生，从而避免细胞受到活性氧伤害[32]，这与本研究低温胁迫下苗期强耐冷型水稻品种东农418通过维持体内低POD活性而减少活性氧的伤害结果相符。本研究室温对照组（CK1）强耐冷型水稻品种东农418的平均POD活性比冷敏感型品种松粳9号低，这与冬小麦[32]中研究结果相似，但是差异产生的具体机制仍需进一步研究。松粳9号钨酸钠和ABA处理组的POD活性变化趋势与其蒸馏水对照组（CK2）相反，推断这是由于钨酸钠抑制内源ABA合成以及喷施外源ABA使水稻叶片内ABA浓度发生变化，通过信号转导途径反馈给POD，使POD发生角色改变，由氧自由基和H2O2清除者转变为诱导者。本研究同一品種钨酸钠和ABA处理组的POD活性变化结果表明，ABA在冷胁迫下所起保护作用是通过减缓POD活性上升速度，使水稻叶片POD活性尽量维持正常水平，从而缓解低温胁迫造成的伤害。

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