聚乙烯醇和海藻酸钠联合固定化汉逊德巴利酵母产3—羟基丙酸的研究

董玉玮　刁咸斌　王陶　张传丽　高明侠

摘要：采用微胶囊固定化技术，利用聚乙烯醇、海藻酸钠和氯化钙制备汉逊德巴利酵母微胶囊，探讨了聚乙烯醇、海藻酸钠、氯化钙的浓度对汉逊德巴利酵母微胶囊的制备工艺及其产3-羟基丙酸量的影响。结果表明，随着聚乙烯醇、海藻酸钠和氯化钙浓度的分别增加，3-羟基丙酸含量先增加后减少。聚乙烯醇最佳浓度为10.0%，此时3-羟基丙酸含量为（20.01±0.66） g/L；海藻酸钠为最佳浓度为1.0%，此时3-羟基丙酸含量为（18.71±0.54） g/L；氯化钙最佳浓度为2.1%，此时3-羟基丙酸含量为（18.37±0.45） g/L。聚乙烯醇和海藻酸钠联合固定汉逊德巴利酵母制备微胶囊最佳工艺为10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸钠和2.1%氯化钙，在此条件下3-羟基丙酸含量为（21.53±1.12） g/L。

关键词：固定化；汉逊德巴利酵母；3-羟基丙酸

中图分类号：TQ926 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0722-05

3-羟基丙酸（3-hp）是一种三碳无手性化合物，是大部分光学物质的前体[1]，能够发生氧化还原反应得到1，3-丙二醇、丙二酸、丙烯酸等化合物[2]，这些化合物对于制备粘胶剂、纤维、塑料、树脂、个人护理用品、水处理药剂等必不可少；3-hp也可以聚合生成聚3-hp，具有强度高、易拉伸、生物降解性好等优点，在环境保护、化学防护等方面具有广泛的应用前景，被誉为21世纪新兴平台化合物[3]。然而3-hp每年产量都不足，存在巨大的市场缺口，加之其重大的应用价值和潜在的开发价值，吸引国内外研究机构争先展开深入的研究。

微生物生产3-hp可以避免化学合成法带来的诸多不良因素，具有生产时间短、材料容易得到、对环境无害、成本低等优势。1982年长谷川等发现皱褶假丝酵母可用于发酵生产3-hp。但是微生物自身存在不稳定、对环境敏感、易死亡、不可再生等缺点。如果引入固定化细胞技术则可以克服这些缺点。固定化细胞技术是指将细胞用物理或化学方法限制或定位在某一特定空间，保留其原有的活性，能被重复和连续使用的技术手段[4]，具有高稳定性、简便、连续化使用、易控制等优点，可提高产物的纯度和过程效率[5，6]。其中包埋法是最常用的微生物固定化方法[7]，而聚乙烯醇、海藻酸钠等有机高分子则可以作为良好的包埋载体材料[8]。

本研究采用经实验室保存并培养的汉逊德巴利酵母，利用聚乙烯醇和海藻酸钠联合进行固定化培养，确定聚乙烯醇、海藻酸钠、氯化钙浓度等研究固定化条件，为后续的研究提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

1）菌种。汉逊德巴利酵母，实验室保存。

2）試剂。海藻酸钠、乙醇、硫酸、苯酚等均为分析纯。

3）培养基。种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，琼脂粉20 g/L，丙酸10 mL。发酵培养基：葡糖糖30 g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L，KH2PO4 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，丙酸10 mL，调节pH至6.0。

4）主要仪器设备。FA21040电子天平，北京精密仪器公司；IXQ-SG46-280A手提式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯有限公司；HZ150L恒温培养摇床，武汉瑞华仪器设备有限责任公司；250D恒温光照培养箱，常州国华电器有限公司；DL-5低速大容量离心机，上海安亭仪器厂；高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 汉逊德巴利酵母的培养 汉逊德巴利酵母的固体培养；采用本实验室斜面保存的汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定，保藏号为CGMCC No.11893。种子培养基，31 ℃恒温培养3 d。汉逊德巴利酵母的液体培养：采用长势较好的汉逊德巴利酵母菌进行液体培养，31 ℃、150 r/min摇床培养3 d，发酵液沉淀过滤后用于3-羟基丙酸测定。

1.2.2 固定化小球的制备 将汉逊德巴利酵母液体发酵液静置0.5 h，过滤后菌体沉淀加入到一定浓度海藻酸钠与聚乙烯醇混合胶体中混匀，菌胶比2∶1。用5号针筒吸取混合液滴入一定浓度的CaCl2溶液中制成固定化小球，粒径约0.3～0.5 cm，常温下固定2 h，4 ℃冰箱固定2 h。小球用无菌水冲洗2～3遍后放入液体培养基，31 ℃、150 r/min摇床培养3 d。

1）聚乙烯醇浓度的确定。分别以8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的聚乙烯醇在1.0%海藻酸钠和2.1%氯化钙的条件下，固定汉逊德巴利酵母，按固定化小球2个/mL培养基接种，100 mL培养基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培养3 d，测定3-羟基丙酸含量。

2）海藻酸钠浓度的确定。分别以0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%的海藻酸钠在10.0%的聚乙烯醇和2.1%的氯化钙的条件下，固定汉逊德巴利酵母，按固定化小球2个/mL培养基接种，100 mL培养基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培养3 d，测定3-羟基丙酸含量。

3）氯化钙浓度的确定。分别以1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%的氯化钙在1.0%的海藻酸钠和10.0%的聚乙烯醇的条件下，固定汉逊德巴利酵母，按固定化小球2个/mL培养基接种，100 mL培养基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培养3 d，测定3-羟基丙酸含量。

1.2.3 3-羟基丙酸的测定 3-羟基丙酸的方法：采用高效液相色谱法，3-羟基丙酸在210 nm有吸收峰，紫外检测器210 nm；色谱柱规格：迪马C18 250×4.6 mm，5 μm；pH范围为1.5～9.0；流动相：3%甲醇-97%水；柱温：35 ℃；流速为0.8 mL/min；进样量为20 μL，检测3-羟基丙酸含量

1）3-羟基丙酸标准曲线绘制。配置浓度梯度为2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的3-羟基丙酸标准工作液，静置过夜后检测。

2）样品中3-羟基丙酸的测定。取固定化汉逊德巴利酵母的培养液经4 000 r/min离心5 min，用0.22 μm滤膜过滤后检测3-羟基丙酸的含量。

1.2.4 数据分析 采用Origin 8.1软件对数据进行作图和统计分析，所有数据用平均数±标准差（x±s）表示。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件的确定

由于底物丙酸、发酵产物3-羟基丙酸以及可能产生的同分异构体乳酸都为有机弱酸，易电离，pH大都在2～3。试验表明，随着流动相pH逐渐增高样品的分离度越低，然而低pH对色谱柱有较大损伤，结合色谱柱自身pH范围，确定流动相pH为2.0。甲醇所占比例越高分离度越低，由此选择pH 2.0含有3%甲醇的流动相。

2.2 3-羟基丙酸标准曲线

根据峰面积与浓度之间的关系求得直线方程。由图1可知，3-羟基丙酸的出峰时间为5.6 min左右。图2为根据峰面积绘制的标准曲线，得一元线性方程y=75.324x-18.625，经显著性检验，R2=0.999 0，说明3-羟基丙酸含量与峰面积之间具有极显著的线性关系。

2.3 固定化小球的制备

2.3.1 高效液相色谱条件的确定 通过试验可知，随着流动相的pH逐渐增高样品的分离度越低，流动相中甲醇所占比列越高分离度越低，由此选择pH 2.0含有3%甲醇的流动相。

2.3.2 聚乙烯醇浓度对固定化小球形态的影响 分别采用8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%聚乙烯醇和1.0%海藻酸钠制备固定化小球。从图3、表1中可以看出，当聚乙烯醇浓度低于9.0%时，固定化小球硬度很软；当聚乙烯醇浓度高于11.0%时，固定化小球硬度很硬；当聚乙烯醇浓度在9.0%～10%时，固定化小球透明度适中，硬度适中，呈球形，尾巴不明显。因此初步选择聚乙烯醇浓度为9.0%～11.0%。

2.3.3 海藻酸钠浓度对固定化小球形态的影响 分别采用0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%海藻酸钠和10.0%聚乙烯醇制备固定化小球。从图4、表2中可以看出，当海藻酸钠浓度低于0.9%时，固定化小球硬度很软；当海藻酸钠浓度高于1.1%时，固定化小球硬度很硬；当海藻酸钠浓度在0.9%～1.1%时，固定化小球透明度适中，硬度适中，呈球形，尾巴不明显。因此初步选择海藻酸钠浓度范围为0.9%～1.1%。

2.3.4 氯化钙浓度对固定化小球形态的影响 采用1.0%海藻酸钠和10.0%聚乙烯醇混合在1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%氯化钙的条件下制备固定化小球。从图5、表3中可以看出，当氯化钙浓度低于1.9%时，固定化小球硬度很软；当氯化钙浓度高于2.3%时，固定化小球硬度很硬；当氯化钙浓度在1.9%～2.3%时，固定化小球透明度适中，硬度适中，呈球形，尾巴不明显。因此初步选择氯化钙浓度范围为1.9%～2.3%。

2.4 固定化细胞发酵液3-羟基丙酸的测定

由图1可知，3-羟基丙酸的出峰时间为5.6 min，图6中5.6 min也有峰出现，3-羟基丙酸含量为4.55 g/L。

2.5 不同聚乙烯醇浓度下3-羟基丙酸含量

根据初步试验可知，在其他相同条件下，聚乙烯醇浓度为9.0%、10.0%、11.0%时制备固定化小球， 31 ℃培养3 d，测定3-羟基丙酸的含量（图7）。从图7可以看出，3-羟基丙酸随着聚乙烯醇浓度的增加，先增加后减少，10.0%的聚乙烯醇为最佳浓度，此时3-羟基丙酸的含量为（20.01±0.66） g/L。

2.6 不同海藻酸钠浓度下3-羟基丙酸含量

根据初步试验可知，在其他相同條件下，海藻酸钠浓度为0.9%、1.0%、1.1%时制备固定化小球，31 ℃培养3 d，测定3-羟基丙酸的含量。从图8可以看出，3-羟基丙酸的含量随着海藻酸钠浓度的增加先增加后减少，1.0%海藻酸钠为最佳浓度，此时3-羟基丙酸的含量为（18.71±0.54） g/L。

2.7 不同氯化钙浓度下3-羟基丙酸含量

根据初步试验可知，在其他相同条件下，氯化钙浓度为1.9%、2.1%、2.3%时制备固定化小球，31 ℃培养3 d，测定3-羟基丙酸的含量。从图9可以看出，3-羟基丙酸的含量随着氯化钙浓度的增加先增加后减少，2.1%的氯化钙为最佳浓度，此时3-羟基丙酸的含量为（18.37±0.45） g/L。

2.8 最佳固定化条件

固定化汉逊德巴利酵母的最佳工艺为聚乙烯醇的浓度10.0%；海藻酸钠的浓度1.0%；氯化钙浓度2.1%。在此条件下3-羟基丙酸含量为（21.53±1.12） g/L，未固定化汉逊德巴利酵母3-羟基丙酸含量为（18.34±0.89） g/L，固定化后3-羟基丙酸含量提高了17.39%。

3 小结与讨论

1）聚乙烯醇和海藻酸钠联合固定化汉逊德巴利酵母的特点。聚乙烯醇需要先冷水溶胀，再热水溶解用于制备，充分的溶胀可以使形成的固定化小球更牢固，同时聚乙烯醇自身进行交联后，可以减少在水中的溶解；由于产物3-羟基丙酸是有机酸，加入聚乙烯醇能提高载体的成球性，保护载体，且聚乙烯醇较海藻酸钠强度更高，因此聚乙烯醇含量（10%）远高于海藻酸钠含量（1.0%），可以保证固定化小球的稳定性；经过多次重复试验，证实联合固定化汉逊德巴利酵母在培养阶段未发生破裂与溶解现象，固定化小球形态没有明显变化。

2）固定化汉逊德巴利酵母较未固定化细胞的优势。目前国内外主要通过菌种诱变、基因重组方式获得高产3-羟基丙酸的菌株，本研究采用固定化工艺固定汉逊德巴利酵母，较未固定化细胞产3-羟基丙酸能力也有一定的提升。与未固定细胞相比，固定化工艺主要的优势包括：①按菌胶比为2∶1和2个固定化小球/mL培养基接种，菌种密度和固定化小球数量都较高，成功获得了较高的3-羟基丙酸含量；②固定化工艺采用制备微胶囊小球，由于体积小，比表面积大，用于发酵培养时，增加了培养基与小球的接触面积，更有利于菌种繁殖和生产3-羟基丙酸；③固定化小球可以重复利用，无需反复接种，尤其是固定化细胞在反复使用过程中，菌种保持较高繁殖能力，生长延迟期很短，节省了生产3-羟基丙酸的时间。

3）从固定化小球形态学判断，较适聚乙烯醇浓度范围是9.0%～11.0%，较适海藻酸钠浓度范围是0.9%～1.1%，较适氯化钙浓度范围是1.9%～2.3%，固定化小球透明度适中，硬度适中，成球形无拖尾。采用高效液相色谱测定3-羟基丙酸含量，确定聚乙烯醇和海藻酸钠联合固定汉逊德巴利酵母最佳工艺为10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸钠，2.1%氯化钙。在此条件下3-羟基丙酸含量为（21.53±1.12） g/L，较未固定化汉逊德巴利酵母3-羟基丙酸含量提高了17.39%。

参考文献：

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