棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

李先良　李居宁　李傲　夏涛

摘要：为研究XTH基因与棉花（Gossypium spp.）纤维伸长的关系，克隆了两个XTH基因，分别命名为GhXTH1（GenBank：AY189971）和GhXTH2（GenBank：JN968478）。GhXTH1编码区全长870 bp，编码289个氨基酸，GhXTH1全长885 bp，编码294个氨基酸。序列分析表明，GhXTH1和GhXTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明，GhXTH1和GhXTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明，GhXTH1和GhXTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明，GhXTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近，GhXTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明，GhXTH1和GhXTH2均随着棉花纤维发育表达量降低，GhXTH2比GhXTH1表达量高。

关键词：棉花（Gossypium spp.）纤维；木葡聚糖转移/水解酶；克隆；表达分析；伸长

中图分类号：S562；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0756-06

棉花（Gossypium spp.）纤维是由胚珠表皮细胞发育而来，成熟纤维细胞长度可为其直径的1 000～3 000倍，有的可达35～40 mm[1]。海岛棉（Gossypium barbadense，Gb）成熟棉纤比陆地棉（Gossypium hirsutum，Gh）长，但在开花后24 d，陆地棉纤维长度比海岛棉纤维长[2]。棉纤维细胞的伸长开始于开花当天[3-5]，纤维细胞伸长速率最大的阶段发生在开花后6～12 d和15～20 d，两个阶段伸长量可达最终长度的80%[6]。

棉纤细胞伸长由细胞内膨压驱动，并伴以细胞壁松弛过程。细胞内渗透溶质增加，促进细胞内渗透压增加，使细胞吸收大量水分，从而使细胞膨压增加，使细胞渗透压增加的溶质主要是可溶性糖、苹果酸盐及鉀离子（K+）[7]。磷酸丙酮酸羧化酶（PEPC）[8]、胞间连丝[9，10]、蔗糖酶（Vacuelar invertase）[11]、水通道蛋白[12]与棉纤细胞膨压产生或增加有关。

棉纤细胞壁是由纤维素、半纤维素和结构蛋白组成的动态网络。半纤维素木葡聚糖是植物细胞初生壁的结构多糖，木葡聚糖链通过共价氢键绑附到纤维素链上，将临近纤维素微纤丝交联起来[13]。微纤丝之间木葡聚糖交联结构是细胞伸长的主要限制因素之一。该交联结构可以被木葡聚糖转移/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/Hydrolase，XTH）解开并重新连接，从而降低细胞伸长的阻力，因此XTH能通过松弛细胞壁进而促进细胞伸长。重组拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）XTH14和XTH26加到根系上，展现出对根系细胞伸长明显的促进作用[14]。在拟南芥中，超表达AtXTH18、AtXTH19、AtXTH20能刺激下胚轴伸长[15]；在棉花中，超表达GhXTH1能增强XTH活性，使棉花纤维长度增加15%～20%[16]。XTH基因在棉花纤维中表达存在时间特异性和品种特异性[17]，在海岛棉和陆地棉花棉花纤维中表达存在差异[18]。XTH基因表达模式与棉花纤维长度存在关联。

本研究从陆地棉中克隆分离两个XTH基因，对其进行序列分析、系统发生学分析和表达分析，以期为了解XTH基因及其家族与棉花纤维伸长之间的关系奠定基础，从而为棉花纤维品质改良特别长度品质改良提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用的棉花材料为陆地棉珂字201、华棉99，海岛棉为军海1号。分别取开花后4、9、14、19、24 d棉瓣放入液氮，然后存入-80 ℃冰箱备用。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α为实验室保存，中间载体pMD18-T购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成

棉花纤维总RNA用热硼酸法提取[19]，并按DNase I试剂盒所示方法处理总RNA，以去除其中DNA，然后用15 μL DEPC ddH2O溶解，分光光度计测定RNA浓度。最后按照Promega反转录酶体系进行操作，合成第1链cDNA，反转录后的cDNA保存于-20 ℃。

1.3 GhXTH1和GhXTH2克隆

在NCBI中有一个XTH全长编码序列（AY189971），另外还存在一个EST序列（DV848907）。对于AY189971，根据其全长序列，从两端设计引物（GhXET-OE-F：5′-AAAGTCGACATTCTCTTTCTGTTTCTCTGGTTTA-3′；GhXET-OE-R：5′-AAAGGTACCTCAGATGATGGACATGCACTC-3′），以14 d棉花纤维cDNA为模板，PCR扩增后测序。对于DV848907，将其与AtXTH序列比对，发现该段EST序列与AtXTH基因5′端同源程度较高，而且同源区包含起始密码子。根据此段EST序列设计引物进行3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends），测序得到一段DNA序列，以该序列与EST序列拼接翻译，发现以EST序列的第三个碱基开始翻译能翻译出一个完整蛋白序列。在该序列内存在两个起始密码子，以第一个起始密码子翻译到蛋白序列长度相对符合XTH蛋白序列长度。RACE方法见参考文献[20]。

1.4 GhXTH生物信息学分析

利用ClustalW软件进行多序列对齐和排序， 使用GenDOC和MEGA5.0软件输出同源比对和进化树构建结果[21]；用SingaIP进行信号肽预测[22]；用ProtParam计算蛋白质的相对分子质量和理论等电点[23]；利用TMHMM预测蛋白质的跨膜结构域。

1.5 GhXTH1和GhXTH2表达分析

UBQ7为RT-PCR分析内参基因，设计引物序列为：GhUBI-RT-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；GhUBI-RT-F：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。GhXTH引物序列为：GhXTH1-RT-F：TCCGTGACAGC

AGATGAGATC；GhXTH1-RT-R：TGGTGCAAACTTA

ACTCCGAC。GhXTH2引物序列为：GhXTH2-RT-F：GGTTTCCGTGACAGCAGATG；GhXTH2-RT-F：GTGCAAACTTAACTCCGACATT。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳。

2 结果与分析

2.1 GhXTH1和GhXTH2全长序列克隆和分析

GhXTH1在NCBI中存在一个全长序列（AY189971），根据该序列设计引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1A），片段大小在750～1 000 bp间。测序结果表明，该序列与AY189971存在一个碱基差别，但蛋白序列完全相符。将该基因命名为GhXTH1。

在NCBI存在GhXTH的一个EST序列DV848907，将该序列与拟南芥中XTH序列比对，发现该序列覆盖该基因的5′端，因此，仅需要进行3′-RACE可得到该基因全长序列，根据试剂盒（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit）说明书，进行3′-RACE，扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳（图1B）。将该片段测序，测序后所得序列与EST拼接，将所得序列在Premier软件进行翻译，发现从第3个碱基开始能翻译出一个蛋白序列。以第一个起始密码子为起始，能翻译出289个氨基酸（aa）。以编码该序列的DNA序列为模板设计引物，用该引物进行PCR扩增（图1C），对该片段进行测序，所得序列与前面的拼接序列完全吻合。將该序列提交NCBI库（JN968478）。

2.2 GhXTH1和GhXTH2蛋白特征分析

GhXTH1全长序列包含289个氨基酸，GhXTH2包含294个氨基酸。将拟南芥和其他几种植物中XTH与克隆得到XTH多序列比对。结果表明，棉花XTH序列与其他XTH序列有比较高的保守性，所有序列都存在维持XTH活性的保守序列DEIDFEFLG[24，25]，但有些序列与之相差1～2个氨基酸（图2）。GhXTH1保守序列与此相差1个氨基酸，第3个氨基酸由异亮氨酸（I）变成了亮氨酸（L）；GhXTH2保守序列与此相差2个氨基酸，第1个氨基酸从天冬氨酸（D）变成天冬酰胺（N），第3个氨基酸从异亮氨酸变成苯丙氨酸（F）。拟南芥XTH家族中多个XTH保守序列存在1～2个氨基酸变化。

XTH是一种细胞壁蛋白，因此，对所获得的两个棉花XTH进行信号肽预测、亚细胞定位预测及等电点等蛋白特征分析。有助于了解其生物学功能。经Protparam程序预测，GhXTH1理论分子质量33.07 ku，理论等电点（pI）为6.38，GhXTH2理论分子质量33.61 ku，理论pI为5.40。通过SignalP 4.1 Server预测，显示GhXTH1和GhXTH2在N端均存在一段信号肽（图3），位置位于第1～25 aa。该信号肽的作用是将该蛋白定位至细胞壁。TMHMM预测GhXTH1和GhXTH2均存在1个跨膜结构（图4），该跨膜结构位于N端，在蛋白序列中信号肽的后面。N-糖基化对维持XTH活性具有重要作用[26]。用NetNGlyc 1.0 Server分析GhXTH1和GhXTH2中 N（天冬酰胺）-糖基化位点。结果表明，GhXTH1存在1个糖基化位点，GhXTH2有两个糖基化位点，GhXTH1和GhXTH2保守序列DEIDFEFLG后面均存在1个糖基化位点。

2.3 GhXTH1和GhXTH2系统发育分析

为了解GhXTH1、GhXTH2与拟南芥XTH之间进化关系，进行系统发育分析（图6）。AtXTHs可以分3类，大部分Ⅰ类XTH成员包含4个外显子，Ⅱ类XTH成员具有2或3个外显子，Ⅲ类XTH成员具有4或5个外显子，且3类XTH C端存在特征序列[25]。但随着AtXTHs与水稻XTHs（OsXTHs）叠加系统发生分析发现，Ⅰ类和Ⅱ类XTH成员分歧已不明显[27]；Ⅲ类显示具有木葡聚糖水解酶活性而不是转糖基酶活性[28]。但酶活性分析表明Ⅲ类酶并不都具有水解酶活性，番茄中的一个Ⅲ类XTH（SIXTH5）表现出转糖基酶活性[29]。因此，XTH系统发生学分类与其活性之间并无关系。GhXTH1与AtXTH6、AtXTH亲缘关系较近，GhXTH2与AtXTH9亲缘关系较近，均属于Ⅰ/Ⅱ类XTH。

2.4 GhXTH1和GhXTH2在棉花纤维发育中的表达分析

为获得两个XTH在不同棉花纤维中随发育时期的表达模式，用克隆到两个XTH序列设计引物，进行半定量分析，以了解两个XTH在陆地棉和海岛棉棉花纤维发育中的表达模式（图7）。结果表明，GhXTH1和GhXTH2在陆地棉和海岛棉表达量均随着棉花纤维发育而下降。在棉花纤维发育的初生壁时期，细胞伸长较快，XTH大量表达能松弛初生细胞壁进而释放因细胞伸长而产生的阻力。在陆地棉和海岛棉中，GhXTH2表达量比对应发育时期GhXTH1表达量高。

3 讨论

利用传统PCR技术和RACE技术，从棉花纤维中分离到两个XTH基因，分别命名为GhXTH1和GhXTH2。序列比对发现它们均存在XTH家族保守基序DEIDFEFLG，该基序不仅在XTH家族中保守，在XTH所隶属的GH16家族中也相对保守[30，31]。从拟南芥和水稻XTH家族保守序列看，该基序在某些位点有些变化。因此，GhXTH1和GhXTH2在该基序上有1～2氨基酸残基变化不影响其成为XTH家族成员。

拟南芥XTH家族包含33个成员，从系统发生学角度可分为3类[32]，GhXTH1和GhXTH2均属于其中Ⅰ类（Group Ⅰ/Ⅱ）。Ⅰ类XTH具有一个共同特征，XTH基因由4个外显子组成，其保守基序位于3个外显子上。但系统发育分类与XTH活性无关[29]，在水稻中，Ⅲ类中两个XTH（OsXTH19，OsXTH20）仅表现出水解酶活性，而Ⅰ类中的OsXTH1具有内转移酶活性和水解酶活性[33]。系统发生分析显示，GhXTH1与AtXTH6、AtXTH7亲缘关系密切，而GhXTH2与AtXTH9亲缘关系较近。将GhXTH1和具有水解酶活性XTH（TmNGX1）进行三维结构比较可知，其在负责水解活性的保守环状结构上存在差异，因此，GhXTH1主要是转糖基酶活性[17]。AtXTH9活性还无报道，但从系统发生分析看，AtXTH9、GhXTH2与GhXTH1关系较近，它们在酶活性上应该是类似的，AtXTH9表达受远红光的正调控[34]。因此，GhXTH2的表达有可能受到红外光的正调控。

XTH具有多种生理功能，包括有细胞生长[15，16，35]、水果软化[29，36]、器官脱落[37，38]、维管形成[39-42]等。水稻3个XTH酶活性类型不同，将它们在水稻中超表达或抑制表达，均不能明显改变水稻表型，说明这3个XTH存在功能冗余[33]。GhXTH1和GhXTH2在棉纤中有较高的表达，说明其与棉花纤维发育有关。GhXTH1在具有更长棉花纤维的棉花品种或者海岛棉中上调表达[17]，说明GhXTH1与棉纤伸长有关，GhXTH1在棉花中超表达后，棉纤转糖基酶活性增加，成熟纤维长度也有增加。GhXTH2在棉花纤维中表达高于GhXTH1，因此，GhXTH2在棉花纤维伸长方面的作用可能比GhXTH1强，但也不能排除GhXTH1和GhXTH2在棉花纤维伸长方面存在功能冗余。

4 结论

获得了两个全长木葡聚糖转移/水解酶基因GhXTH1和GhXTH2全长cDNA序列，GhXTH1和GhXTH2均含有信号肽和跨膜结构，这表明其是定位于质膜上的分泌性蛋白。GhXTH1和GhXTH2均含有XTH家族的保守基序DEIDFEFLG，且在基序后存在糖基化位点，该基序和糖基化是XTH产生活性必需的，这说明所获得两个序列具有该家族的一般特性。系统发生学分析表明，GhXTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近，GhXTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。GhXTH1和GhXTH2均随着棉花纤维发育表达量降低，GhXTH2比GhXTH1表达量高。

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