米邦塔仙人掌多糖提取工艺的研究

徐丛玥++林款++茹琴++梁征++李超英

摘要：对热水提取米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）粗多糖的提取工艺进行研究。以新鲜米邦塔仙人掌为原料，采用单因素试验考察料液比、提取温度、提取时间和提取次数对米邦塔仙人掌粗多糖得率的影响，并通过响应面法优化工艺参数。结果表明，影响粗多糖得率的因素主次顺序为提取温度>料液比>提取时间。确定最佳提取工艺参数为提取温度83 ℃，料液比1∶28（g∶mL），提取时间为3 h，在此条件下，仙人掌粗多糖的得率为2.05%。

关键词：米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）；粗多糖；提取；响应面法

中图分类号：S682.33；TS201.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0927-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.034

Studies of Extraction Technique of Polysaccharide from Opuntia milpa alta Haw

XU Cong-yue1， LIN Kuan1， RU Qin1， LIANG Zheng1， LI Chao-ying1，2

（1. Wuhan Institutes of Biomedical Sciences， Jianghan University， Wuhan 430056， China；

2. Hanjea Biological Technology （Wuhan） Limited Liability Company， Wuhan 430075，China）

Abstract：Polysaccharide in fresh Opuntia milpa alta Haw was extracted with hot water. The effects of the ratio of material to water，extraction temperature，extraction time and extraction times on the yield of polysaccharide were investigated by single factor experiments. Subsequently，a quadratic regression rotational combinational design was employed，and data obtained were analyzed with response surface methodology. Polysaccharide yield was most significantly affected by extraction temperature，followed by water to material ratio，and extraction time. An optimum polysaccharide yield of 2.05% was obtained when opuntia milpa alta was treated at 83 ℃ for 3 h in a material-to-water ratio of 1∶28（g∶mL）.

Key words：Opuntia milpa alta Haw； polysaccharide； extraction； response surface methodology

由于仙人掌（Opuntia stricta）悠久的藥用历史、丰富的营养活性成分及易于栽培等因素，在农学、食品及医学等方面已经受到广泛关注[1]。米邦塔仙人掌是1997年中国农业部从墨西哥米邦塔地区引进的食用仙人掌，富含多种营养成分，如钙、钾、锌、铁等矿物质、蛋白质、维生素，还含有多种活性功能成分，如多糖类、黄酮类、生物碱类等[2]。黏液质细胞和黏液质是仙人掌植物的特征之一，其中含有大量糖类物质，而多糖是仙人掌重要的功能成分。目前，对仙人掌多糖的提取纯化、药理功能及应用开发等方面研究较多，因此仙人掌多糖的提取工艺及其应用已具备了实际价值[3]。

米邦塔仙人掌多糖的提取方法有很多种，如热水提取、酶法提取、稀酸或稀碱提取以及微波或超声波辅助提取法[4]，但研究最广泛的是热水提取法。采用热水提取法提取多糖受许多因素影响，如料液比、提取温度、提取时间及提取次数等，需经过合理设计和试验才能得到最佳工艺。蔡为荣等[5]采用水提法提取仙人掌多糖，用响应面分析法得到最佳提取条件为提取温度86.1 ℃，提取时间3.61 h，料液比 1∶3.72，多糖得率为0.694%；刘洋等[6]用相同的响应面分析法提取仙人掌多糖，得到最佳工艺条件为料液比1∶5.5，提取温度75 ℃，提取时间2.2 h，浸提1次，在此条件下，仙人掌粗多糖的实际得率为0.81%。

响应面法（RSM）是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归分析优化工艺参数，可以形象、直观地解决工艺优化问题[7]。因此，本试验通过响应面法优化热水法提取米邦塔仙人掌粗多糖工艺参数，旨在提高仙人掌粗多糖提取率，为仙人掌多糖进一步的功能活性研究及开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜米邦塔仙人掌，购自江苏宿迁繁星花卉园艺中心；无水乙醇、95%乙醇、丙酮、无水乙醚、浓硫酸、苯酚、三氯乙酸、阿拉伯糖等均为分析纯；考马斯亮蓝G250试剂盒，购自武汉博士德生物有限公司。

DFY-1000V型高速万能粉碎机，上海比朗仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪，SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵，上海亚荣生化仪器厂；FD-1A-50型冷冻干燥机，上海豫明仪器有限公司；高速落地冷冻离心机，德国BECKMAN公司；全波长酶标仪，美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 米邦塔仙人掌粗多糖提取工艺流程 新鲜米邦塔仙人掌→预处理→仙人掌干粉→热水提取→离心→取上清液，加4倍体积95%乙醇静置12 h→离心→沉淀加500 mL去离子水复溶→浓缩→三氯乙酸法除蛋白质→透析除杂→取上清液，加4倍体积95%乙醇静置12 h→离心→分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次→冷冻干燥→得到米邦塔仙人掌粗多糖。

1.2.2 操作要点 预处理[8]：取新鮮米邦塔仙人掌洗净、去皮、切片，置于80 ℃烘箱内烘干，然后粉碎成粉末，过60目筛，以1∶2的料液比添加石油醚，脱脂脱色素后晾干，密封保存。

热水提取：精确称取10.0 g米邦塔仙人掌干粉，按设定水提条件（料液比、提取温度、提取时间）进行提取试验，得到粗多糖浸提液。

采用三氯乙酸法除去蛋白质[9]：等体积加入3%三氯乙酸溶液，搅拌均匀后于4 ℃静置12 h，10 000 r/min离心10 min，上清液用NaOH调pH至中性，重复操作3次。

1.2.3 米邦塔仙人掌粗多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量[10]，以阿拉伯糖为标准品测定粗多糖中多糖含量。粗多糖得率=粗多糖重量/仙人掌干粉重量×100%。

1.2.4 单因素和响应面试验 通过单因素试验，分别考察料液比、提取温度、提取时间、提取次数对米邦塔仙人掌粗多糖得率的影响。根据单因素试验结果，以料液比、提取温度和提取时间为参数，以粗多糖得率为响应值，按照Design-Expert 10.0分析软件中的Box-Behnken中心组合设计法，设计三因素三水平的响应面试验，并对数据进行分析，得到响应面回归方程，进一步寻找最优工艺参数。

2 结果与分析

2.1 热水提取仙人掌粗多糖工艺单因素试验

2.1.1 料液比对仙人掌粗多糖得率的影响 固定提取温度为75 ℃，提取3 h，提取1次，调节料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL，下同），考察不同料液比对粗多糖得率的影响，结果如图1所示。由于多糖等大分子物质的溶解度不高，因此提取过程中用水量是一个重要因素。由图1可知，随着料液比的增加，仙人掌粗多糖得率明显增加，当料液比为1∶30时粗多糖得率最大。仙人掌中水分较高，黏性强，烘干后加水提取依然黏稠，当料液比较低时，溶液呈糜状，需要较强的搅拌力度，不容易分离多糖，且损失较大；增加料液比，有利于粗多糖的提取。

2.1.2 提取温度对仙人掌粗多糖得率的影响 固定料液比为1∶20，提取3 h，提取1次，提取温度分别设定为65、70、75、80、85、90 ℃，分析不同提取温度对仙人掌粗多糖得率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在65～85 ℃，仙人掌粗多糖得率随着温度的升高而增加，但85 ℃后，温度升高粗多糖得率反而下降。可能是因为温度过高，粗多糖稳定性降低，高温条件下部分粗多糖降解，因此提取温度不宜太高。

2.1.3 提取时间对仙人掌粗多糖得率的影响 固定料液比为1∶20，提取温度75 ℃，提取1次，设计提取时间为1、2、3、4、5 h，考察不同提取时间对仙人掌粗多糖得率的影响，结果见图3。由图3可知，提取时间在2 h以内，仙人掌粗多糖得率增加，时间过长粗多糖得率反而下降。在粗多糖提取过程中，粗多糖浸出程度与时间有关，时间过短，提取不充分，但时间过长，可能会引起粗多糖结构的变化从而降低得率。

2.1.4 提取次数对仙人掌粗多糖得率的影响 在料液比1∶20，提取温度75 ℃，提取时间3 h的条件下，考察提取次数对仙人掌粗多糖得率的影响，结果见图4。由图4可知，第1次粗多糖得率为1.5%，提取2次累计为1.7%，而第3次粗多糖得率仅为0.1%。重复提取3次，粗多糖得率增加不明显，而且增加提取次数会使后续浓缩任务加重，延长提取时间，考虑到提取成本，因此选择提取1次。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计 为优化单因素试验得到的工艺条件，根据Box-Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，选择料液比（X1）、提取温度（X2）和提取时间（X3）3个对仙人掌粗多糖得率影响较大的因素为自变量，以粗多糖得率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析。结合前期单因素试验结果，设计响应面试验各因素水平（表1），具体试验方案和结果如表2所示。

响应面分析试验共有15个试验，其中1～12号为析因试验，13～15号为中心试验。析因点是三个自变量构成的三维顶点为区域的中心点，三个中心试验则用来估计试验误差。

2.2.2 模型方差分析 通过Design-Expert 10.0软件对数据进行分析，得到响应面回归方程，回归模型方差分析结果见表3，回归方程各系数显著性分析结果见表4，回归方程中各系数的估计值见表5。

从表3回归方差分析可知，该模型P<0.01，方程模型达到极显著，失拟检验P=0.473 322>0.05，影响不显著，说明无失拟因素存在。该回归模型的总决定系数R2=0.996 7，调整决定系数R2Adj=0.990 7，说明该模型的拟合程度较好，试验误差小。故此回归方程模型成立，可以用此模型对热水提取米邦塔仙人掌粗多糖进行分析和预测。

由表4可知，热水提取米邦塔仙人掌粗多糖的工艺参数中，料液比、提取温度、提取时间3个因素对仙人掌粗多糖的影响均极显著。在所选取的各因素水平范围内，影响粗多糖得率的因素主次顺序为提取温度（X2）>料液比（X1）>提取时间（X3）。料液比（X1）与提取时间（X3）存在交互作用，达到显著水平。

对表4中的各项数据进行回归拟合，得到表5中各项系数的估计值，故自变量与米邦塔仙人掌粗多糖得率的二次多项回归方程为Y=2.056 67+0.036 25X1+0.057 50X2+0.033 75X3-0.007 50X1X2-0.010 00X2X3+0.007 50X2X3-0.018 33X12-0.050 83X22-0.013 33X32。

2.2.3 响应面分析 热水提取米邦塔仙人掌粗多糖工艺中料液比、提取温度和提取时间3个因素之间的交互作用对粗多糖得率的影响见图5、图6和图7。

等高线的形状可直观地看出交互作用的强弱，椭圆形反映了两因素的交互作用较强，呈圆形則相反，而响应面曲线较陡也说明交互作用较强。由图5可知，与料液比相比，提取温度的响应面曲线较陡，对仙人掌粗多糖得率的影响较大，说明提取温度对粗多糖得率的影响较料液比明显。由图6可知，提取时间与料液比的交互作用对仙人掌粗多糖得率的影响显著。由图7可知，随着提取温度和提取时间的同时增加，仙人掌粗多糖得率也在增大。

根据Design-Expert 10.0软件分析得到最优提取工艺参数为料液比1∶27.96，提取温度82.97 ℃，提取时间2.99 h，此时仙人掌粗多糖得率为2.10%。为检验响应面法优化米邦塔仙人掌粗多糖提取工艺的可靠性，采用优化后的提取条件进行验证试验。参考实际操作，将优化的工艺参数调整为料液比1∶28，提取温度为83 ℃，提取时间为3 h。在此条件下，仙人掌粗多糖得率为2.05%，与理论预测值基本吻合。因此，利用此模型优化得到的工艺参数真实可靠，具有可行性和实用价值，测得该粗多糖中多糖含量为54.18%。

3 小结

本研究采用热水法提取米邦塔仙人掌粗多糖，为进一步优化热水法提取粗多糖的工艺条件，考察了料液比、提取温度、提取时间和提取次数4个因素对仙人掌粗多糖得率的影响。

通过单因素试验和响应面试验，得到影响粗多糖得率的因素按主次顺序排列：提取温度（X2）>料液比（X1）>提取时间（X3）。确定最佳提取工艺参数为料液比1∶28，提取温度83 ℃，提取时间3 h，在此条件下，仙人掌粗多糖的得率为2.05%，多糖含量为54.18%。

参考文献：

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[4] 杨 宁.仙人掌多糖的分离纯化及降血糖的研究[D].广州：华南理工大学，2007.

[5] 蔡为荣，顾小红，汤 坚.仙人掌多糖的提取及其结构初步研究[J].食品与机械，2007，23（4）：68-71.

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[10] 赵龙岩，袁清霞，李子娇，等.仙人掌多糖的双酶法提取及含量测定的优化[J].中国医药工业杂志，2011，42（2）：96-100.