莲藕节中多酚提取工艺优化

周玮婧++李书艺++王文娟

摘要：利用作为废弃物的莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）节资源，采用乙醇超声浸提的方法从莲藕节中提取多酚。通过单因素试验确定了乙醇体积分数、料液比、pH、温度和时间对莲藕节中多酚提取率的影响，并进一步通过响应面试验进行分析和实际应用考虑，确定蓮藕节中多酚提取的最佳工艺条件为pH 4.0，温度40 ℃，乙醇体积分数61.04%，料液比1∶20.53（m∶V），提取时间45.20 min，经过该工艺优化后莲藕节多酚提取率提高至6.27%。对通过优化工艺提取的莲藕节多酚进行抗氧化性能测定，结果显示莲藕节多酚有较好的清除DPPH自由基的能力。

关键词：莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）节；多酚；提取工艺；优化

中图分类号：S645.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0938-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.037

Technology Optimization for Extracting Polyphenol from Lotus Festival

ZHOU Wei-jing1，LI Shu-yi2，WANG Wen-juan2

（1.Wuhan Institute for Food and Cosmetic Control， Wuhan 430000， China；2.College of Food Science & Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract： In order to make full use of the resources of lotus festival as wastes，the optimal conditions for extraction yield of polyphenol from lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival，so this issue with lotus festival for raw materials，ethanol ultrasonic extraction method for extracting polyphenol from multiple intersecting in. By single factor test to determine the alcohol concentration，solid-liquid ratio，pH，temperature and time on lotus festival polyphenol extraction and further analysis and consideration of the practical application of response surface experiments to determine the lotus root section of the ultrasonic extraction of polyphenol. The process conditions were pH 4.0， temperature of 40 ℃， ethanol concentration 61.04%， solid-liquid ratio of 1∶20.53（m∶V），extraction time 45.20 min. It is better for industrialized extraction and lotus festival polyphenol maximum extraction yield 6.27%. The polyphenol from lotus festival have strong scavenging effects to DPPH radicals.

Key words： lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival； polyphenol； extraction technology； optimization

多酚具有较强的抗氧化特性，可以清除体内自由基，从而达到预防心血管疾病、延缓衰老的作用，植物多酚大部分都存在于植物的根、茎和叶子中。莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）为睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，在中国栽培历史悠久，种质资源丰富，是传统的出口蔬菜，分布在湖北、湖南以及浙江等地。莲藕的根、茎、叶到果实各个部位都是宝，有开胃消食、清热解毒、滋生养性的功效，其中莲藕节还可以用于治疗咳血、尿血等疾病，具有较高的药用价值。莲藕节是莲的干燥根茎节部，质地较硬，附有一些须根及须根痕[1]。中国每年消费大量的莲藕，但由于有些部位不可食用，以及贮藏期很容易发生酶促褐变等原因，产生大量莲藕废弃物，然而莲藕废弃物中仍具有许多加工潜力的活性物质。莲藕节就是其中一种，其含有多种有效成分如多酚。有研究表明[2]，莲藕的平均多酚含量约为117 mg/100 g（FW），主要由多巴、儿茶酚、没食子酸、儿茶素和表儿茶素等组成。所以作为莲藕的主要功能活性成分，多酚的制备开发对促进产业精深加工并延展产业链具有重要意义，使莲藕节更具有加工价值。

本研究从莲藕节中提取多酚，通过单因素试验和响应面试验优化确定莲藕节中多酚的超声辅助浸提工艺，得出最佳的莲藕节多酚提取率，并通过体外化学体系评价提取物的抗氧化活性，为莲藕节的综合利用和加工以及藕节中多酚类物质的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的莲藕藕节，购于当地市场；没食子酸（分析纯），购于上海金锦乐实业有限公司；无水乙醇（分析纯），购于深圳市华昌化工有限公司；福林酚试剂（分析纯），购于合肥BIOSHARP生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7200型紫外分光光度计（德国斯派克分析仪器公司）；R-3型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；CHRIST ALPHA 2-4型真空冷冻干燥机（武汉利天科技仪器有限公司）；DS-1型高速组织捣碎机（上海标本模型厂）；FuheHH-4型數显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；SH2-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 莲藕节中多酚提取流程 称取10 g莲藕节并粉碎成渣→加入一定料液比的乙醇溶液→置于控温超声场中浸提→真空抽滤→旋蒸至10 mL→定容至25 mL→混匀后测定多酚含量。

1.3.2 测定莲藕节中多酚含量 精密量取1.0 mL莲藕藕节样品溶液于10 mL刻度试管中，加5 mL去离子水，摇匀1 min后加1.5 mL 20% Na2CO3溶液，加入0.5 mL福林酚试剂，用去离子水定容至10 mL，室温反应2 h，以去离子水为空白对照，在760 nm波长处测定样品溶液的吸光度[3]。

1.3.3 多酚提取率计算 莲藕节中多酚提取率按公式（1）计算：

X=■×100% （1）

式中，X为多酚提取率（%）；n为稀释倍数；C为多酚质量浓度（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；m为莲藕节质量（g）。

1.3.4 莲藕节多酚提取工艺优化 在其他条件一致时，分别以乙醇体积分数、料液比、pH、温度和时间作为试验因素，每个因素分别设置5个水平进行单因素试验，并根据试验数据分析每个因素对莲藕节中多酚提取的影响。通过单因素试验，得出每个因素条件下莲藕节多酚的提取率，从中选出对莲藕节多酚提取率影响较大的3个因素，进行三因素三水平响应面试验。

1.3.5 莲藕节多酚清除DPPH自由基能力 取不同稀释度的莲藕节多酚提取液2 mL和2×10-4 mol/L的DPPH甲醇溶液2 mL，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30 min后于515 nm处测定其吸光度，并用维生素C溶液作为阳性对照，去离子水为空白对照，计算莲藕节多酚对DPPH·的清除率[4]， DPPH自由基清除率按公式（2）计算：

P=（1-■）×100% （2）

式中，A0为去离子水空白试剂的吸光度；A1为不同浓度提取液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 多酚含量标准曲线制作

精确称取干燥至恒重的没食子酸10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配成0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液。移液管依次准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL没食子酸标准溶液于10 mL刻度试管中，按照“1.3.2”方法测定吸光度，以没食子酸的质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。计算回归方程为y=0.994 9x-0.075 4，R2=0.995 4。通过线性方程计算样品中多酚含量，并根据公式折算出莲藕节多酚提取率。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对莲藕节多酚提取率的影响 在提取时间20 min、料液比1∶15（g∶mL，下同）、提取温度40 ℃和pH 4.0的条件下，测定不同乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）对莲藕节多酚提取效果的影响。如图2所示，不同体积分数的乙醇溶液对莲藕节中多酚提取率有影响，随着乙醇体积分数的增加，提取率逐渐增大，当乙醇体积分数为60%时，莲藕节中多酚的提取率最大，但随着乙醇体积分数的继续增加，多酚提取率呈下降趋势，故莲藕节中多酚提取的乙醇体积分数选为50%～70%。

2.2.2 料液比对莲藕节多酚提取率的影响 在提取时间20 min、60%乙醇、提取温度40 ℃和pH 4.0的条件下，测定不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）对莲藕节多酚提取效果的影响。如图3所示，随着料液比的增加，莲藕节多酚的提取率逐渐增加，当料液比为1∶20时，莲藕节多酚提取率达到最大值，在料液比1∶15以下和1∶25以上时多酚提取率变化不明显，故莲藕节多酚提取的料液比范围选定为1∶15～1∶25。

2.2.3 pH对莲藕节多酚提取率的影响 在提取时间20 min、60%乙醇、提取温度40 ℃、料液比1∶15的条件下，将pH分别调为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，分析不同pH对莲藕节多酚提取效果的影响。如图4所示，在pH为2.0～6.0时，莲藕节多酚提取率变化不大，所以pH的变化对莲藕节多酚提取率影响不大。

2.2.4 温度对莲藕节多酚提取率的影响 在提取时间20 min、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的条件下，测定不同提取温度（20、30、40、50、60 ℃）对莲藕节多酚提取效果的影响。如图5所示，温度对莲藕节多酚提取率的影响不明显，在20～60 ℃莲藕节多酚提取率变化不明显。据文献报道[5]，温度的升高有利于植物中多酚类物质的溶出和扩散，从而提高多酚的浸提效率，但由于本试验采用超声浸提的方法，超声作用掩盖了温度的影响，所以使得温度对多酚提取率的影响较小。

2.2.5 提取时间对莲藕节多酚提取率的影响 在提取温度40 ℃、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的条件下，测定不同提取时间（5、10、20、40、60 min）对莲藕节多酚提取效果的影响。如图6所示，随着超声提取时间的增加，莲藕节中多酚提取率明显增大，但在超声处理20 min后，多酚提取率增加较缓慢。随着提取时间的延长，多酚提取率基本不变，由于超声处理时耗能较大，从经济、节能的角度综合考虑，将较为理想的莲藕节多酚提取时间选为20、40、60 min。

2.3 莲藕节中多酚提取的响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计 根据单因素试验选择3个关键因素乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）和提取时间（X3）为研究对象，以莲藕节多酚提取率为响应值，进行三因素三水平响应面试验。响应面试验因素与水平如表1所示，响应面试验结果如表2所示，在17组处理组合中12组为分析因素试验，5组为零点。

2.3.2 响应面试验结果的方差分析 试验数据采用Design-Expert 9.0统计软件对响应面结果进行回归分析，得出乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）和提取时间（X3）对莲藕节多酚提取率的影响可以用二次多项回归方程表示为Y=6.20+0.21X1+0.16X2+0.39X3-0.09X1X2-0.16X1X3-0.019X2X3-0.75X12-0.66X22-0.71X32。对超声波辅助乙醇提取莲藕节中多酚的数学模型进行方差分析，结果见表3。从表3可以看出，模型一次项X1、X3，二次项X12、X22、X32均极显著，一次项X2影响显著，交互项X1X2、X1X3、X2X3均不显著，因素影响的顺序为X3>X1>X2。

其中二次响应面回归模型的F值为44.25，P<0.000 1，且Y的模型确定系数为R2=0.902 7，说明该模型能解释90.27%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，自变量与响应值之间线性关系显著，因此可用此模型对莲藕节中提取多酚工艺进行分析和预测。

2.3.3 响应曲面分析与优化 按照回归方程进行软件编程运算，得到交互因子的响应面图，当乙醇体积分数、料液比和提取时间这3个因素当中的一个因素固定时，另外2个因素及其交互作用对莲藕节多酚提取率的影响见图7、图8、图9。根据数据分析得出，莲藕节多酚的提取率随着乙醇体积分数的增大而增加，但当乙醇体积分数增大到一定程度后，多酚提取率有下降的趋势；料液比也表现出和乙醇体积分数一样的趋势，即莲藕节多酚提取率随着料液比的增大先增大后略微减小。然而提取时间的变化是随着时间的增加，多酚提取率增大，由响应曲面的陡峭程度可知，提取时间对莲藕节多酚提取率的影响极显著，其次是乙醇体积分数，这与方差分析结果一致。乙醇体积分数（X1）与提取时间（X3）的作用最为明显。

根据Design Expert 9.0软件建立二次多项回归模型，经检验该模型合理可靠，可用于莲藕节中多酚的提取。根据模型优化，采用RSREG Procedure分析得到一个极值点（Y=6.27%），即从莲藕节中提取多酚的最优工艺参数为乙醇体积分数为61.04%，料液比1∶20.54，提取时间45.20 min。在此条件下，莲藕节多酚提取率为6.27%。

2.4 莲藕节中多酚提取的抗氧化活性试验

从图10可以看出，维生素C和莲藕节多酚对DPPH自由基都有较强的清除能力，并且随着浓度的增加，清除率也逐渐增加。当莲藕节多酚提取液的浓度达到400 μg/mL时，对DPPH自由基清除率达到60%以上。但莲藕节的IC50为153.76 μg/mL，略高于维生素C，表明莲藕节中多酚的清除能力比维生素C弱，这可能与莲藕节的多酚提取物为粗提物有关。

3 小结

结合单因素试验和响应面试验结果分析，以提取率为指标优化莲藕节多酚的超声波提取条件为乙醇体积分数61.04%，料液比1∶20.53，提取時间45.20 min。在这个条件下所提取的莲藕节多酚提取率为6.27%。影响莲藕节多酚制备效果的各因素主次关系为提取时间>乙醇体积分数>料液比，应用该方法制备莲藕节中的多酚，其工艺较为简单、操作较方便快捷。

莲藕节中多酚的抗氧化性研究结果表明，在测定DPPH自由基清除率中，莲藕节多酚的IC50为153.76 μg/mL，说明莲藕节多酚有一定的抗氧化能力，并且随着样品浓度的增加，莲藕节中的多酚对DPPH的清除力先增强后趋于水平。试验表明，莲藕节多酚作为一种天然抗氧化剂，具有广阔的开发应用前景，但在试验中从莲藕节中提取的多酚含量仍然不是很高，还需要进一步优化分离纯化方法提高其纯度。

参考文献：

[1] 熊桂云，童 军，刘冬碧，等.湖北省莲藕生产与施肥现状调查[J].湖北农业科学，2011，50（19）：3934-3939.

[2] 郭长江，韦京豫，杨继军，等.66种蔬菜、水果抗氧化活性的比较研究[J].营养学报，2003，25（2）：203-207.

[3] 杨冬梅.莲藕抗氧化特性研究[D].杭州：浙江大学，2007.

[4] 刘焕云，刘月英，陈延峰，等.莲藕皮多酚的提取及抗氧化性能研究[J].林产化学与工业，2011，31（2）：87-90.

[5] 严守雷.莲藕多酚提取分离鉴定及生物活性研究[D].武汉：华中农业大学，2003.