三种方法对肉松中胆固醇含量的测定及比较

朱炳祺++刘柱++陈万勤

摘要：采用直接皂化方法对样品进行前处理，用乙醚和石油醚混合液（1∶1）萃取，用气相色谱、液相色谱和比色法分别进行检测。气相、液相色谱法在25～500 mg/L范围内具良好的线性关系（R2>0.999），比色法在0～42 mg/L范围内具良好的线性关系（R2>0.997）。液相、气相色谱和比色法3个加标浓度平均回收率分别为105.5%、100.1%和102.3%，检出限分别为0.1、0.4和2.1 mg/100 g，对肉松中胆固醇含量测得值分别为52.2、51.2和102 mg/100 g。3种方法均很好地满足方法学要求，其中比色法体现总固醇类化合物的含量；气相色谱法和液相色谱法专属性更强、灵敏度更高，能更准确地反应样品中胆固醇含量。

关键词：胆固醇；肉松；气相色谱法；液相色谱法；比色法

中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0942-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.038

Determination of Cholesterol Contents in Dried Meat Floss

and Comparison of 3 Different Methods

ZHU Bing-qi， LIU Zhu， CHEN Wan-qin， LUO Jin-wen

（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310000， China）

胆固醇在人体内起着广泛的生理作用，是动物细胞中不可缺少的重要物质，其不仅仅是细胞膜的组成物质，也是胆汁酸、维生素D和甾体激素的原料[1]。胆固醇主要来源为两个，其中80%是人体自身合成，其次20%是从食物中获取。世界卫生组织（WHO）和联合国粮食与农业组织（FAO）将300 mg设置为成年人每日最大建议摄入量[2]。尽管并没有充足的数据来揭示从食物中过量摄入胆固醇与动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病之间的直接关系[3]，但大量研究表明两者之间存在相关性[4，5]，高水平的低密度胆固醇提高了心血管疾病的风险[6]，因此在相关领域这一直是一个重要的课题[1]。

在针对胆固醇的化学检测分析手段中，主要使用了比色法、荧光发光法、液相色谱法和气相色谱法等[1，2]。其中气相色谱法和液相色谱法能够将胆固醇分离并进行定量分析，因此较为常用[7]。通常固醇类物质在190～210 nm处有吸收，因此在液相方法中常使用紫外检测器；气相色谱柱分离性好、灵敏度高，通常配备FID或质谱检测器[2，5]。比色法利用固醇类与酸作用时脱水聚合产生颜色物质以进行定量分析[8]。在国家标准中，规定了高效液相色谱法GB/T 22220-2008，肉与肉制品中胆固醇含量测定GB/T 9695.24-2008和食品中胆固醇的测定GB/T 5009.128-2003为法定方法对胆固醇进行检测，但鲜有报道将上述3种方法同时进行比较。

本试验通过直接皂化法处理样品，利用比色法、高效液相色谱法和气相色谱法3种方法分别测定肉松中胆固醇的含量，进行方法学验证，比较3种方法的优缺点，为实验室开展胆固醇的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉松；鱿鱼；胆固醇（纯度≥95%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；甲醇、无水乙醇（色谱纯，德国Merck公司）；石油醚（沸程30～60 ℃）；无水乙醚；无水硫酸钠；氢氧化钾。以上试剂如无特别说明均为分析纯，试验用水为Millipore超纯水。

1.2 仪器设备

天平（Mettler XPE205，美国Mettler Toledo公司）；气相色谱仪（7890B，FID检测器，美国Agilent公司）；液相色谱仪（1260，DAD检测器，美国Agilent公司）；紫外可见分光光度仪（Lambda 35，美国Perkin Elmer公司）；旋转蒸发仪（RV10，德国IKA公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品处理 胆固醇样品皂化：将样品粉碎混匀，精密称取固体样品于具塞锥形瓶中，加入30 mL无水乙醇，超声5 min，加入60% 氢氧化钾溶液10 mL，置于80 ℃ 恒温水浴中皂化20 min，取出超声5 min，继续放回80 ℃水浴中皂化20 min，取出摇匀、冷却至室温。

胆固醇提取：将皂化液全部转移至250 mL分液漏斗中，用30 mL水分2～3次冲洗具塞锥形瓶，冲洗液并入分液漏斗，再用50 mL石油醚和乙醚混合液（1∶1）分2～3次冲洗锥形瓶并入分液漏斗中，振摇提取2 min，静置，分层。转移水相于第二个分液漏斗中，再用40 mL上述石油醚和乙醚混合液重复提取一次，弃去水相，合并有机相。用蒸馏水洗涤提取液至中性。弃去水相，无水硫酸钠去水。

提取液浓缩：液相色谱法和气相色谱法中将提取液转移至250 mL平底烧瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩至近干。无水乙醇溶解定容至5 mL，取过滤液于进样小瓶中，待测。比色法中将提取液转移至容量瓶，用石油醚和乙醚混合液（1∶1）定容至100 mL。

1.3.2 液相色谱法 色谱柱，Waters SunFire（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；检测器，二极管阵列检测器；检测波长205 nm；流动相为100%甲醇；流速1.0 mL/min；柱温38 ℃；进样量10 μL。

1.3.3 气相色谱法 色谱柱，DB-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气，高纯氮；恒流2 mL/min；柱温（程序升温）：初始温度为200 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；进样口温度280 ℃；检测器温度310 ℃；进样量1 μL；进样方式为分流进样，分流比10∶1；空气流速400 mL/min；氢气流速30 mL/min。

1.3.4 比色法 移取定容后的提取液5 mL，置于10 mL具塞试管中，在65 ℃水浴中氮气吹干，加入4 mL冰乙酸，2 mL铁矾显色液，混匀，在15～90 min内，在563 nm波长下比色，测吸光度，根据标准曲线计算相应胆固醇含量。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

胆固醇通常以结合的形态存在于样品中，通过皂化，将其水解成游离态的胆固醇以供分析。该过程涉及皂化碱液浓度、皂化时间、皂化温度等因素。

皂化过程中，充足的氢氧化钾保证反应能够完全进行[9，10]。反应时间是胆固醇充分水解的必要条件，试验考察了反应40、60和90 min，均取得了一致的胆固醇含量，故表明反应40 min即可。合适的温度为反应的进行提供能量，相关研究表明在60 ℃时反应不完全，但过高的温度也会带来副反应，因此80～90 ℃较为理想[9，10]。试验加入10 mL 60%氢氧化钾水溶液，采用了40 min的反应时间和85 ℃的皂化温度。为了样品均匀反应，对其进行超声处理，并在皂化过程中振摇。

萃取溶剂的选择中，正己烷的回收率较低，乙醚和石油醚均有90%以上的回收率[9]。依据GB/T 22220-2008，本试验中采用乙醚∶石油醚（1∶1）为萃取溶剂。

2.2 方法学验证

本次试验对肉松样品分别进行了液相法、气相法和比色法3种考察方法。在液相色谱法和气相色谱法中，将胆固醇标准品用无水乙醇溶解配制稀释成25～500 mg/L的标准溶液，待色谱仪分析，制作标准曲线。在比色法中，将标准储备液定量稀释至0.1 mg/mL的中间液，分别定量移取中间液置于10 mL试管内，加入冰乙酸使总体积为4 mL，加入2 mL铁矾显色液，混匀，在15～90 min内，在563 nm波长下比色，以胆固醇标准浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。精密称取样品，经样品处理后，进行含量测定、加标考察、精密度試验和检出限试验。

图1和图2分别为胆固醇测定的气相色谱和液相色谱，根据“1.3.2”和“1.3.3”中的仪器参数设置进行分析，胆固醇得到较好地分离，在气相色谱和液相色谱中保留时间分别为9.292和12.635 min。

由表1可以看出，3种方法均呈现出良好的线性关系。3种方法均进行了25、50和100 mg/100 g 3个加标浓度的回收考察试验，每个浓度点平行3份，扣除样品背景后液相法、气相法和比色法分别得到105.5%、100.1%和102.3%的回收率。精密度试验中平行测定6份肉松样品中胆固醇含量，得到的RSD%均小于5。由于样品为阳性样品，故在检出限的测定中色谱法对样品进行稀释至S/N=3，比色法采用检出限CL=3Sb/b[b方法校正曲线的斜率；Sb空白值标准偏差（平行测定20次）]计算得到，色谱法的检出限比比色法低一个数量级。3种方法的验证指标均符合国标要求，其中实验室获得的液相色谱法检出限明显优于GB/T 22220-2008的规定。

2.3 3种方法对胆固醇检测结果的分析

对本试验所使用的肉松样品进行检测结果见表2。由表2可知，利用液相色谱法和气相色谱法得到的结果平均值分别为52.2 mg/100 g和51.2 mg/100 g，而利用比色法测得的结果为102.0 mg/100 g，较色谱法结果高出近1倍。根据GB/T 5009.128-2003，比色法适用于固醇类化合物，该固醇类化合物与酸作用时，可脱水发生聚合反应，产生颜色物质。由于样品中含有除了胆固醇以外的固醇类化合物，同样会发生显色反应，干扰胆固醇的测定，因此导致比色法的结果较色谱法高。在此次研究中平行对鱿鱼样品进行胆固醇检测，其中气相、液相和比色法得到的结果平均值分别为145、144、187 mg/100 g，该结果同样反映出比色法所得的结果较气相色谱和液相色谱法高。相关研究用比色法和HPLC法对鸭蛋蛋黄粉中的胆固醇含量进行比较，比色法所得结果也明显高于HPLC法，同样是由于蛋黄粉中脂类成分干扰所致[8]。

3 结论

本试验对常用的气相色谱法、液相色谱法和比色法在胆固醇的检测中进行了比较和方法学考察。优化了样品处理中皂化温度、时间和萃取过程。在对肉松的检测中，气相色谱法和液相色谱法均能将胆固醇与其他固醇类和脂类成分在分析过程中进行分离，故能取得较为准确的结果。而比色法则由于未进行分离，故检测结果反映的是样品中总固醇含量。

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Abstract： Saponification was applied in sample pretreatment， and cholesterol was extracted by a mixed solvent of diethyl ether and petroleum ether （1∶1，V/V），then analyzed by liquid chromatography（LC），gas chromatography（GC） and colorimetric method respectively. The results showed that good linearity were obtained in the range of 25～500 mg/L by using chromatography （R2>0.999） and in 0～42 mg/L by colorimetric method （R2>0.997）. By using LC，GC and colorimetric method，the average recovery were 105.5%，100.1% and 102.3%，the limit of detection（LOD） were 0.1 mg/100 g，0.4 mg/100 g and 2.1 mg/100 g， and the cholesterol content in dried meat floss were 52.2 mg/100 g， 51.2 mg/100 g and 102 mg/100 g respectively. All three analytical methods were validated， among which the colorimetric method revealed the total steroid content，and LC，GC were more accurate and sensitive in cholesterol analysis than colorimetric method.

Key words： cholesterol； dried meat floss； gas chromatography； liquid chromatography； colorimetric method