柿EST—SSR标记在柿属植物中的通用性研究

罗纯　张青林　罗正荣

摘要：公共数据库和柿转录组测序产生的大量EST序列为开发新的SSR标记提供了有效资源。我们在前期利用这些数据开发出112个EST-SSR标记，此次研究选用其中11个标记对柿属（Diospyros L.）15个种20份试材进行了标记通用性检测。结果表明，所有引物均能扩增出产物，多态性引物比率达100%，并且UPGMA聚类结果可靠，说明柿EST-SSR标记在近缘种中可以通用。上述通用性标记为柿属植物遗传多样性研究提供了标记资源。

关键词：柿属植物（Diospyros L.）；EST-SSR标记；通用性

中图分类号：Q949.775.3；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5434-04

简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记技术通常又称为微卫星标记（Microsatellites），它是指以1～6个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列。与其他分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、共显特性、易用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）检测、重复性强、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点[1]。根据SSR的来源可将其分为基因组SSR和表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）-SSR。EST是来自随机选取的特定处理的cDNA克隆末端序列，能反映mRNA的信息，在功能基因组研究中具有重要意义。EST-SSR与基因组SSR标记相比，具有不同物种间通用性较好、开发方法简单及成本低廉等优点[2]。而且EST-SSR标记来自于基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息，所以现在已成为重要的农作物农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型工具。目前，大麦（Hordeum vulgare L.）[3]、小麦（Triticum aestivum L.）[3]、油菜（Brassica campestris L.）[4]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[5]等许多农作物已从公共数据库中成功地开发出了大量的EST-SSR标记。

柿（Diospyros kaki Thunb.）是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）植物中作为果树栽培的代表种，其栽培历史已有二千余年。中国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。目前，已利用多种分子标记技术对柿属植物进行了遗传分析，如Du等[6]在柿上开发了反转座子标记，Guo等[7]利用简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）技术开发了SSR标记。我们也开发了EST-SSR和靶位区域扩增多态性（Target region amplified polymorphism，TRAP）标记[8，9]，并在柿品种间进行了遗传分析，但是这些标记对于柿属其他种植物是否能通用尚需进一步试验。本研究利用前期开发的11个EST-SSR标记对柿属15个种20份试材进行了标记通用性评价，旨在为柿及其近缘种种质鉴定及遗传多样性分析提供实用、高效的研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料和模板DNA的提取

利用柿属15个种的20份材料（表1）进行标记通用性评价。采用CTAB法提取材料基因组DNA，参照程运江等[10]的方法并作适当改动。试验所用引物序列基本信息见表2。

1.2 扩增反应体系

PCR反应体系20 μL，其中包括：1×Buffer，20 ng DNA 模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，0.8 μmol/L 引物，1 U Taq酶。扩增反应是在德国Biometra TProfessional PCR仪上进行，扩增程序如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，55 ℃（不同引物退火温度不同）复性1 min，72 ℃延伸75 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。试验所用引物序列的基本信息及各引物退火温度见表2。

1.3 凝胶电泳及银染

SSR扩增产物通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染[11，12]，用数码相机拍照保存电泳图谱。根据图谱分析各EST-SSR位点的扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同种中所得到的等位基因数量，根据DNA分子量标准估算等位基因片段的大小。

1.4 遗传多样性分析

对11个柿EST-SSR位点在20份柿近缘种中的扩增结果DNA谱带进行数字化统计，有带的位置记为1，无带的位置记为0。将所有试验数据在Microsft Office Excel 2003软件里进行标准化处理，利用NTSYSpc 2.10e分析软件构建数据矩阵；在Simint程序下选择Dice系数计算20份柿近缘种间的遗传相似系数，采用非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相应的系统树状树，通过聚类划分类群来完成聚类分析。

2 结果与分析

2.1 柿EST-SSR引物在柿近缘种中的扩增结果

11对柿EST-SSR引物在20份柿近缘种中的扩增结果分别见表3、图1。由表3可以看出，在所有的11对EST-SSR引物中，以引物1430、5845与5553的通用性最高，可在所有20份柿近缘种材料中得到扩增片段；而其他8对引物都在某些材料中没有扩增产物出现，如引物460在丽江君迁子1以外的其他近缘种中都得到了扩增产物；引物6665也有较高的通用性，除了在丽江君迁子1和丽江君迁子4中没有得到扩增产物外，在其他的近缘种中都得到了清晰的扩增条带。引物8125、4379和9004在3个近缘种中无扩增产物。引物1554、6615、8917在4个近缘种中无扩增产物，通用性稍低。

2.2 EST-SSR扩增图谱分析

对11个EST-SSR位点在20份柿属植物中的扩增图谱（图1）进行分析。结果表明，在扩增与否和各位点扩增的等位基因数量方面，不同种间存在着差异。从EST-SSR位点的扩增情况来看，丽江君迁子1除了引物1430、5845、8125和5553可得到目的扩增产物外，在其他7个位点中均无扩增产物，可扩增位点较少；乌材、丽江君迁子4和丽江君迁子6分别得到7、6、7个可扩增位点；青茶柿、象牙树、丽江君迁子3和苗山柿各自除一个位点外，其他10个位点均能有效扩增；其他12份近缘种材料在所供试的EST-SSR位点均有目的产物扩增出来。

从表3各EST-SSR位点所得到的等位基因数目来看，各近缘种所得到的等位基因数目差异较小。各个近缘种材料在8917、1430位点上扩增得到的等位基因数较多，其中，岭南柿在8917位点上得到等位基因数目最多，为8个。位点1554所表现的多态性较低，除黑皮柿和青茶柿分别扩增出2个和3个等位基因外，所检测的其他材料在该位点上表现为单态或无扩增。

2.3 UPGMA聚类分析

20份柿近缘种EST-SSR分析的UPGMA聚类分析结果见图2。从图2可见，由于试验材料是柿属中不同的种，除各类君迁子外，其他种间的相似系数都比较低。所有材料中，最大的Dice相似系数为0.909（丽江君迁子3和丽江君迁子5之间），最小的为0.059（乌材和岭南柿之间）。乌材与供试其他材料之间的相似系数均很小，说明乌材与之的亲缘关系都非常远，是否是个更古老的野生种，有待进一步确认。而各类君迁子之间的亲缘关系较近，聚在一起后与浙江柿相聚，说明浙江柿是与君迁子亲缘关系最近的一个近缘种。

3 小结与讨论

为检测在柿栽培种中开发的EST-SSR引物对其近缘种的通用性高低，我们利用11对EST-SSR引物，以20份柿近缘种为试材进行了测试。结果这11对引物均能扩增出产物，且多态性引物比例为100%，表明柿EST-SSR引物对其近缘种是可通用的，而且显示的多态性频率很高。EST-SSR标记引物是根据其侧翼序列设计的，因此侧翼序列的保守程度决定着EST-SSR引物在不同种间的通用性。试验中，不同EST-SSR引物的通用性不同，引物1430、5845与5553在所有20份柿近缘种材料中都能成功扩增，而引物1554、6615、8917在4个近缘种中无目的扩增产物，这很可能就是它们各自对应EST-SSR的侧翼序列的保守程度不同所造成的。

20份柿近缘种的UPGMA聚类分析结果表明，供试的EST-SSR标记在种间进行遗传分析是比较可靠的。比如各类君迁子属于同一个种，它们能够很好地聚在一起，并且与浙江柿亲缘关系较近，此结果与前人研究的一致[13]。

与基因组SSR标记相比，由于EST-SSR来源于基因组编码序列，其保守程度更高，因此比基因组SSR具有更高的种间通用性[2，14，15]。目前，高通量测序技术可以产生海量的EST序列，这为大量开发EST-SSR标记提供了充足的序列来源。试验前期分别利用公共数据库及自主转录组测序获得的柿EST序列开发了100余个EST-SSR标记，根据本试验的结果，柿EST-SSR标记具有很高的种间通用性，这就有效地弥补了柿近缘种分子标记的不足，提高了该标记的利用价值，为柿近缘种的种质鉴定及遗传分析等研究工作提供了标记资源。

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（责任编辑 王 珞）

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