乌饭叶中黄酮、多酚的提取及其抗氧化性研究

王芳+张庆庆+乔璐+叶建芬

摘要：通过响应面分析法优化乌饭（Vaccinium bracteatum Thunb.）叶黄酮、多酚的提取工艺，并研究其体外抗氧化活性。结果表明，乌饭叶黄酮、多酚的最佳提取工艺条件为提取溶剂50%乙醇，料液比1∶41，提取时间50 min，提取温度83 ℃，该条件下黄酮、多酚得率分别为33.4、23.5 mg/g。乌饭叶提取液清除DPPH·、·OH的IC50分别为4.8、11.3 μg/mL，其清除能力强于维生素C；同时，其还原能力强于维生素C，说明乌饭叶提取液具有较强的抗氧化活性。

关键词：乌饭（Vaccinium bracteatum Thunb.）叶；黄酮；多酚；提取；抗氧化活性

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4158-06

the Extraction of Flavonoids and Polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves and Its Antioxidant Activity

WANG Fang， ZHANG Qing-qing， QIAO Lu， YE Jian-fen

（College of Chemistry and Life Science， Zhejiang Normal University， Jinhua 321004， Zhejiang， China）

Abstract：The extraction process of flavonoids and polyphenols from Vaccinium oracteatum Thunb. leaves （VBTL） was optimized with response surface method and the antioxidant activity of the product was studied. The results showed that the optimal extraction conditions of flavonoids and polyphenols were 50% ethanol， liquid/solid ratio of 1∶41， extraction time of 50 min and extraction temperature of 83 ℃. Under these conditions， the yields of flavonoids and polyphenols were 33.4 and 23.5 mg/g， respectively. Extracts from VBTL were found to have excellent DPPH· and ·OH scavenging activities with IC50 values of 4.8 and 11.3 μg/mL， respectively. It had stronger scavenging activity than VC had. It is indicated that the extracts have strong antioxidant capacity.

Key words： Vaccinium oracteatum Thunb. leaf； flavonoids； polyphenols； extraction； antioxidant activity

乌饭（Vaccinium bracteatum Thunb.）又名南烛、乌饭子等，杜鹃花科越橘属，是一种药食兼用植物。乌饭树叶中含有丰富的蛋白质、多糖、维生素及黄酮、多酚类物质[1，2]，具有轻身养颜、黑发明目、促进视红素再合成、改善血液微循环、抗病毒、抑菌性、抗氧化、抗癌防癌等多种生理活性[3-7]。乌饭树在我国分布较广，民间将其叶浸米制作乌米饭，将其果用于制作果酱和酿酒，但没有形成工业化生产，乌饭树综合利用率低[1]。因此，开发和利用乌饭叶中黄酮类物质等活性成分，不仅能使资源得到有效利用，而且能带来巨大的经济和社会效益。本试验采用响应面法对乌饭叶黄酮、多酚的提取工艺进行优化，通过研究乌饭叶提取液清除DPPH·、羟自由基的能力和还原能力，来评价其抗氧化活性，以期为乌饭叶的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌饭叶：采购于金华农贸市场，室温自然阴干，匀浆机粉碎后冷藏备用。

芦丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自Sigma公司；抗坏血酸购自上海山浦化工有限公司，所用试剂均为分析纯。

仪器：粉碎机（九阳股份有限公司）；UV-1000型紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；BT224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SC-5A型超级恒温槽（宁波海曙亿恒仪器有限公司）；离心机（Eppendorf公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮、多酚得率的测定方法

1）黄酮得率测定。芦丁标准曲线的绘制：分别吸取1.0 mg/mL的标准芦丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加去离子水至3.0 mL，加5%亚硝酸钠0.5 mL，混匀放置6 min，加10%硝酸铝0.5 mL，混匀放置6 min，加5%NaOH 2.5 mL，混匀放置15 min，用去离子水定容至10 mL，以不加芦丁标准液作空白对照，在波长490 nm处测定吸光度值。以吸光度为横坐标，芦丁浓度为纵坐标，绘制标准曲线[8，9]。endprint

黄酮得率计算：称取1.0 g乌饭叶，浸提，上清液定容至100 mL，按制作标准曲线的方法测定其吸光度值，由线性回归方程计算黄酮得率。

黄酮得率=C×10-3×[V/（V1×M）]×100%

其中，C为由标准曲线方程得出的黄酮浓度（mg/mL）；V为供试液体积（mL）；V1为测定所用样品量（mL）；M为乌饭叶质量（g）。

2）多酚得率测定。称取1.0 g乌饭叶，浸提，上清液定容至100 mL，取待测液2 mL于50 mL容量瓶中，依次加入8 mL去离子水和10 mL酒石酸铁溶液；同时，做空白对照，分别取10 mL去离子水和10 mL酒石酸铁溶液于容量瓶中，用磷酸缓冲液定容，静置10 min，在波长540 nm处测定其吸光度，根据吸光度等于1.000时，相当于7.826 mg多酚计算得率[10]。

多酚得率=[（A×7.826）/103]×[T/（V×M）]×100%

其中，A为样液的吸光度值；T为供试液总量（mL）；V为测定所用样品量（mL）；M为乌饭叶质量（g）。

1.2.2 乌饭叶黄酮、多酚提取工艺 通过单因素试验分别考察提取溶剂乙醇（0、30%、50%、70%、95%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）（g：mL，下同）、提取温度（20、35、50、65、80 ℃）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）4个因素对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响。

在单因素的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取料液比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）为自变量，乌饭叶黄酮、多酚得率为响应值设计响应面试验，因素和水平见表1。

1.2.3 抗氧化活性 称取20.0 g乌饭叶干粉，按“1.2.2”所得最佳工艺进行提取，经旋转蒸发、冷冻干燥后得到浸膏，置于4 ℃避光储存备用。

1）乌饭叶提取液对DPPH·的清除能力的测定。将浸膏配制为黄酮浓度分别为（1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL）的水溶液，各取0.5 mL，加入0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液3.0 mL，混匀，室温避光反应30 min，用紫外可见分光光度计在波长517 nm处测定其吸光度值Ai。同时，空白组（Aj）以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组（Ac）以等体积去离子水代替样品溶液，以维生素C作阳性对照[11，12]。

清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

其中，Ac为对照组吸光度值；Ai为样品吸光度值；Aj为空白组吸光度值。

2）乌饭叶提取液对羟自由基（·OH）清除能力的测定。在试管中依次加入2.5 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL，样品溶液（将浸膏配制成黄酮浓度分别为5.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μg/mL的水溶液）2.0 mL，2.5 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，混匀，静置10 min，再加入2.5 mmol/L的水杨酸溶液2.0 mL，摇匀，静置30 min后于波长510 nm处测其吸光度值Ai。同时，空白组（A0）以等体积去离子水代替样品溶液，对照组（Aj）以等体积去离子水代替水杨酸，以维生素C作阳性对照[13]。

清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

其中：A0为空白组吸光度值；Ai为样品吸光度值；Aj为对照组吸光度值。

3）还原力的测定。将浸膏配制为不同黄酮浓度（30.0、45.0、60.0、75.0、90.0 μg/mL）的水溶液，各取2.5 mL加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液的混合液中，置于50 ℃水浴20 min。取出，在反应混合物中加入2.5 mL 10%的TCA（三氯乙酸），混合后以3 000 r/min离心10 min。然后，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%氯化铁混匀，室温静置10 min后在波长700 nm处测定吸光度，以维生素C作阳性对照[14]。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

绘制芦丁标准工作曲线（图1），用最小二乘法作线性回归，得出芦丁浓度与吸光度值关系曲线的回归方程为y=0.090 4x+0.000 1，R2=0.999 7。表明在一定范围内，该方法线性关系良好，可以用来进行乌饭叶黄酮得率的测定。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响 由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，乌饭叶黄酮和多酚得率也随之增大，当乙醇体积分数为30%时，黄酮得率达到最大值1.1%；在乙醇体积分数为50%时，多酚得率达到最大值0.9%，这可能是当乙醇体积分数达到最佳时，乌饭叶中醇溶性的黄酮苷元成分和水溶性的糖苷成分的溶解度最大，当体积分数过大时，一些醇溶性杂质、脂溶性物质的溶出量增加，从而影响了黄酮、多酚的浸出[15]。故综合考虑选取50%乙醇进行后续试验。

2.2.2 料液比对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响 由图3可知，随着料液比的升高，乌饭叶黄酮、多酚得率也不断增加，但当料液比超过1∶40之后，黄酮得率无明显变化，而多酚得率呈下降趋势，这可能是当原料量一定时，随着提取溶剂的增加，乌饭叶中黄酮、多酚溶出量随之增大，但当提取溶剂达到一定程度，乌饭叶中有效成分已基本溶出，此时继续增加提取溶剂，脂溶性物质随之增加，不利于乌饭叶中有效成分的提取[16]。故选取料液比为1∶40进行后续提取试验。

2.2.3 提取温度对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响 由图4可知，乌饭叶黄酮得率随着提取温度的升高而增大，当温度达到80 ℃时，黄酮得率达到2.8%；当温度达到65 ℃时，多酚得率明显增大，80 ℃时达到2.1%，这可能是随着提取温度不断升高，分子运动加快，黄酮、多酚的溶解度不断增大，且高温易导致细胞膜破损，有利于有效成分从组织细胞转移到提取溶剂中，增加了有效成分的溶出量[17]。同时， 由于乙醇的沸点为78 ℃，故选取提取温度为80 ℃为宜。endprint

2.2.4 提取时间对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响 图5结果表明，随着提取时间的增加，乌饭叶黄酮得率变化不明显，而1.0 h后黄酮得率明显下降；当提取时间为1.0 h时，多酚得率达到最大值1.8%，之后，多酚得率明显下降。这可能是1.0 h时，有效物质已基本溶出，而长时间的高温可能会破坏已溶出的有效成分[18]，导致黄酮、多酚得率下降。故选择提取时间为1.0 h为宜。

2.3 响应面法试验结果

根据表2的试验结果，利用Design-Expert软件对试验数据进行回归拟合后，得到X1、X2、X3与黄酮得率、多酚得率之间的二次多项回归方程。黄酮得率=3.22+0.2 X1+0.32 X2-0.17 X3-0.11 X1X2+0.17 X1X3-0.15 X2X3-0.26 X12-0.25 X22-0.37 X32，多酚得率=2.28+0.21 X1+0.21 X2-0.16 X3-0.098 X1X2+0.088 X1X3-0.088 X2X3-0.31 X12-0.17 X22-0.30 X32。

对回归模型进行方差分析，结果见表3、表4。由表3可以看出，回归模型显著，拟合程度和可信度较好，试验误差较小，可以用此模型对黄酮得率进行分析和预测。对模型回归方程系数进行显著性检验和方差分析（表3），结果表明料液比（X1）、二次项X12、X32对黄酮得率有显著影响，提取温度（X2）对其有极显著影响。影响乌饭叶黄酮得率的3个因素按大小依次为提取温度（X2）、料液比（X1）、提取时间（X3）。

由表4可以看出，回归模型显著，拟合程度和可信度较好，试验误差较小，可以用此模型对多酚得率进行分析和预测。对模型回归方程系数进行显著性检验和方差分析（表4），结果表明X1、X2、X12、X32对多酚得率有显著影响。提取温度（X2）和料液比（X1）对乌饭叶多酚得率的影响均大于提取时间（X3）对多酚得率的影响。

2.4 响应面分析

用Design-Expert软件对表2数据进行回归拟合后，得到不同提取条件对乌饭叶黄酮得率、多酚

得率影响的响应面（图6-11）。图6至图11直观地

反映各因素的改变对乌饭叶黄酮、多酚得率的影响，分析3组响应面曲线图可知，料液比（X1）和提取温度（X2）对乌饭叶黄酮、多酚得率有显著影响，表现

为曲线陡峭；提取时间（X3）对乌饭叶黄酮、多酚得率影响较小，表现为曲线相对平缓。

2.5 乌饭叶黄酮、多酚提取工艺条件的优化

通过Design-Expert软件优化，得到乌饭叶黄酮最佳提取条件为料液比1∶40.6，提取温度83.5 ℃，提取时间0.8 h，此时黄酮最大得率理论值为34.0 mg/g；多酚最佳提取工艺条件为料液比1∶40.9，提取温度83.2 ℃，提取时间0.8 h，此时多酚最大得率理论值为24.0 mg/g。考虑到实际操作的便利性，将最佳提取工艺修正为50%乙醇，料液比1∶41，提取温度83 ℃，提取时间50 min。在此优化工艺下进行验证试验，实际测得黄酮、多酚得率分别为33.4、23.5 mg/g，与理论值接近，表明该工艺可行，具有实用价值。

2.6 抗氧化试验结果

2.6.1 清除DPPH·的能力 从图12可知，一定浓度范围内，随着供试溶液浓度的增加，维生素C和乌饭叶提取液对DPPH·的清除率随之增大。维生素C和乌饭叶提取液清除DPPH·的IC50分别为10.1、4.8 μg/mL，说明乌饭叶提取液具有较维生素C更强的清除DPPH·的能力。

2.6.2 清除·OH的能力 由图13可知，一定浓度范围内，乌饭叶提取液清除·OH的能力随着浓度增大而增强，呈现剂量效应关系。维生素C和乌饭叶提取液清除·OH的IC50分别为93.6、11.3 μg/mL，说明乌饭叶提取液具有较强的清除·OH的能力，且强于维生素C。

2.6.3 还原能力 图14结果表明，一定浓度范围内，乌饭叶提取液和维生素C的吸光度值随着其浓度的增加而增大。维生素C和乌饭叶提取液黄酮浓度为90.0 μg/mL时，其吸光度值分别为0.921、1.773，说明乌饭叶提取液具有较强的还原能力，且强于维生素C。

3 结论

采用响应面法优化乌饭叶黄酮、多酚的提取工艺，得到最佳提取工艺为提取溶剂50%乙醇、料液比1∶41、提取时间50 min、提取温度83 ℃，该条件下黄酮、多酚最大得率分别为33.4、23.5 mg/g。

乌饭叶提取液具有较强的抗氧化性，随提取液中黄酮浓度的升高，清除DPPH·、·OH和还原能力增强。其清除DPPH·、·OH的IC50分别为4.8、11.3 μg/mL；而维生素C清除DPPH·、·OH的IC50分别为10.1、93.6 μg/mL；还原力测定中，维生素C和乌饭叶提取液黄酮浓度为90.0 μg/mL时，其吸光度值分别为0.921、1.773，说明乌饭叶提取液具有较维生素C更强的抗氧化活性。

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