枸杞花中总多酚含量的测定

程刘柯+贝盏临+张欣

摘要：以水和95%乙醇为提取剂，采用超声提取法提取宁夏枸杞 （Lycium barbarum L.） 花中的多酚类化合物。结果表明，水提取物和95%乙醇提取物中多酚类化合物分别含有60.75 mg和13.55 mg，总量为74.30 mg，约占干枸杞花的1.49%。

关键词：枸杞 （Lycium barbarum L.）；没食子酸；总多酚

中图分类号：O657.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4164-03

Determing the Total Polyphenol Content in Lycium barbarum Flowers

CHENG Liu-ke， BEI Zhan-lin， ZHANG Xin

（College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021， China）

Abstract： Using H2O and 95% ethanol solution as extractant， polyphenol compounds were extracted from the dry flowers power of flowers of Lycium barbarum L. in Ningxia with ultrasonic-wave method. The results showed that 60.75 mg and 13.55 mg of polyphenol compounds were obtained from the extractive by H2O and 95% ethanol， solution respectively， accounting for 1.49% of dry flower.

Key words： Lycium barbarum L. flower； gallic acid； total polyphenol

枸杞（Lycium barbarum L.）全身是宝，《本草纲目》记载，“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞花通常单生或二至数朵簇生于叶腋或短枝上紫色或淡紫色，花梗细，花期4～10月。对枸杞的药用成分及药用机理等相关研究已相当深入。

多酚是一大类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，其含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。狭义上认为植物多酚是单宁或鞣质；广义上还包括小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、栎精、没食子酸等[1，2]。目前植物多酚在很多方面都有深入研究[3-5]，例如，在农业生产（用于制螯合肥料），生态环境保护（用来降低废水中重金属毒害），食品工业（用作天然抗氧化剂），医药（具有抑菌、抗病毒、抗癌等作用）等方多面都有深入的研究，多酚类化合物具有很大的应用价值。对枸杞花方面，沈剑明等[6]研究了宁夏枸杞的花联合现象，刘兰英等[7]对枸杞花色素提取工艺进行了研究，贝盏临等[8，9]研究了枸杞花的抗氧化活性、作用以及其总黄酮的含量，其他有关枸杞花有效成分方面的研究尚未见报道。本研究对枸杞花的总多酚含量进行了相关研究，旨在为今后探索枸杞花的活性功能因子，为枸杞花的食用和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 新鲜的枸杞花于2012年8月采自宁夏中宁县康滩枸杞园，标本保存于北方民族大学生物科学系植物标本室。将新鲜枸杞花（宁杞1号）放置于阴凉处阴干，然后用粉碎机进行粉碎，粉碎后的粉末放入干净的密封塑料袋中保藏备用。

1.1.2 药品 没食子酸、Folin-Ciocalteu（1 mol/L）、碳酸钠、无水乙醇（99.5%），以上试剂均为分析纯，均购自北京化学试剂公司。

1.1.3 试验器材 FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、FA2104B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、KQ-500B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、减压蒸馏装置、ALPHA型冷冻干燥机（德国Marin Christ 公司）、4K15型离心机（Sigma公司）、UV765型紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

1）水提取物的制备。称取粉碎后的枸杞花5.0 g，置于250 mL锥形瓶，加入去离子水100 mL，用超声仪（40 kHz，50 ℃）超声提取50 min，得到的提取液经真空抽滤，得到澄清的提取液。残渣用去离子水洗涤，并在相同的条件下提取2～3次，收集提取液，合并，减压蒸馏得到浓缩液。

2）乙醇提取物的制备：向去离子水提取后的枸杞花残渣中加入60%的乙醇溶液，提取方法及步骤与去离子水提取方法相同。然后，再依次用85%和95%的乙醇对经60%乙醇提取后的残渣再次进行提取。合并以上60%、85%和95%乙醇提取液，对所得提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取液。将以上所得的乙醇提取液在-70 ℃下冷冻过夜。最后，用真空干燥机进行真空干燥，真空干燥时间为27 h，干燥结束后收集粉末状物质。向粉末状物体中加入95%乙醇溶液，得到可溶于95%乙醇溶液与不溶于95%乙醇溶液的沉淀。经10 000 r/min离心15 min后，得到上清液，上清液即为溶于95%乙醇溶液，记录最终体积，标记为样品95%乙醇提取物，4 ℃下保藏备用。离心得到的沉淀加入适量的去离子水，大部分溶于去离子水，再经10 000 r/min离心15 min，得到溶于去离子水的上清液，此上清液与去离子水提取物溶液合并到一起，并记录最终的总体积，标记为样品水提取物，在4 ℃下保藏备用。endprint

1.2.2多酚类化合物的测定 多酚类化合物的测定方法参照[10-12]，略有改动。

1）最大吸收波长的确定：精确称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，即得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。精确吸取0.05 mg/mL没食子酸标准溶液2 mL，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；充分混匀后，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。同时，以未加入没食子酸的溶液作为空白溶液，于紫外-可见分光光度计在400～900 nm下进行扫描。检测最大吸收峰，最大吸收峰为753 nm。

2）多酚类化合物标准曲线的绘制：精确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，于已标记好0、1、2、3、4、5、6、7号的25 mL棕色容量瓶中；再依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；最后用去离子水定容到25 mL；充分混匀，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。以0号作对照，于753 nm处测定不同浓度的没食子酸对应的吸光值。其中，0-7号标准样最终得到的浓度为0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3组重复，取平均值，绘制标准曲线，并得出回归方程。

3）样品水提取物中多酚类化合物的测定：将样品水提取物稀释10倍；精确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液体于已标记好0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中。其余步骤同上。做3组重复，以0号作对照，于753 nm处测定吸光度。取平均值，记录各组数据，绘制出吸光度随样品水提取物体积变化的曲线。在曲线上找到样品水提取物稀释10倍，取1 mL样品所得到的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得出样品水提取物的多酚类化合物的含量。

4）样品95%乙醇提取物中多酚类化合物的测定：精确吸取样品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已标记0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中，其他步骤同样品水提取物的测定步骤。记录各组数据，绘制出吸光度随样品95%乙醇提取物体积的变化曲线。在曲线上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所对应的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得到95%乙醇提取物的多酚类化合物的含量。

由水提取物与95%乙醇提取物分别测定的多酚类化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚类化合物的含量。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取所得体积

样品水提取物的总体积为81 mL，样品95%乙醇提取物的总体积为126 mL。根据样品的总体积计算多酚类化合物和黄酮类化合物的总量。

2.2 多酚类化合物结果分析

在400～900 nm范围内进行扫描，检测出最大吸收峰波长为753 nm。由以上数据及曲线（表1-表3；图1-图3）表明，多酚类化合物标准曲线的线性回归方程为：y= 100.500 0x+0.013 5（R2=0.999 3）。以没食子酸为标准品测定的多酚类化合物标准曲线呈现较好的线性关系。

样品水提取物稀释10倍后，测定多酚类化合物得到的线性回归方程为：y=0.325 2x-0.006 0 （R2=0.998 3）。则样品水提取物稀释10倍后，取1 mL测定的吸光度为0.319 2，由标准曲线得到的没食子酸浓度为0.003 0 mg/L，则样品水提取物的多酚类化合物总量为60.75 mg。样品95%乙醇提取物中多酚类化合物测定得到的线性回归方程为：y= 0.399 3x+0.045 5 （R2=0.993 4）。同样的可以计算出样品95%乙醇提取物中多酚类化合物总量为13.55 mg。可知多酚类化合物大多可溶于水，水溶性的多酚类化合物为醇溶性的4.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚类化合物为74.30 mg，即枸杞花中多酚类化合物含量约占1.49%。

3 小结与讨论

采摘的宁夏本地的枸杞花阴干后，对干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反复提取，并借用超声波（40 kHz）在50 ℃下提取50 min。得到的提取物经减压浓缩，真空抽滤等步骤，最终得到水相（样品水提取物为81 mL）和醇相（样品95%乙醇提取物为126 mL）两种提取物。采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为参照品，在753 nm处测定样品水提取物、95%乙醇提取物中多酚类化合物，得到两者含量分别为60.75 mg和13.55 mg，很显然水相中的多酚类化合物比醇相中的多，是其4.48倍，其中总多酚类化合物含量为74.30 mg，约占干枸杞花的1.49%。

参考文献：

[1] 尹志娜.植物多酚分离提取方法和生物功能研究进展[J].生命科学仪器，2010，8（6）：43-49.

[2] 李群梅，杨昌鹏，等.植物多酚提取与分离方法的研究进展[J].保鲜与加工， 2010，10（1）：16-19.

[3] 李 健，杨昌鹏.植物多酚的应用研究进展[J].广西轻工业， 2008（12）：1-3.

[4] 陈 曌，曾健青，左雄军，等.迷迭香脂溶性抗氧化剂总酚测定及其稳定性研究[J].中国食品添加剂，2011（2）：83-86.

[5] 陈 晨，文怀秀，罗智敏，等.白刺色素和黑果枸杞色素中花色苷与总多酚的测定[J].光谱实验室.2010，27（5）：1796-1798.

[6] 沈剑明，刘晓峰.宁夏枸杞的花联合现象[J].西北植物学报， 1990，10（3）：221-224.

[7] 刘兰英，曹有龙.枸杞花花色素提取工艺研究[J].安徽农业科学， 2010，38（32）：18140-18141.

[8] 贝盏临，张 欣，曹君迈，等.枸杞花总黄酮的测定[J].湖北农业科学，2012，51（6）：1240-1241.

[9] 张 欣，曹君迈，贝盏临，等.枸杞花抗氧化作用的研究[J].江苏农业科学，2012，40（3）：301-303.

[10] 韩 菊，魏福祥.Folin-Ciocalteu比色法测定苹果渣中的多酚[J]. 食品科学，2010，31（4）：179-182.

[11] 李巨秀，王柏玉.福林-酚比色法测定桑葚中的总多酚[J].食品科学，2009，30（18）：292-295.

[12] 丁 明，钟冬莲.茶油中总酚的测定方法[J].浙江农业科学， 2010，30（6）：1369-1371.endprint

1.2.2多酚类化合物的测定 多酚类化合物的测定方法参照[10-12]，略有改动。

1）最大吸收波长的确定：精确称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，即得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。精确吸取0.05 mg/mL没食子酸标准溶液2 mL，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；充分混匀后，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。同时，以未加入没食子酸的溶液作为空白溶液，于紫外-可见分光光度计在400～900 nm下进行扫描。检测最大吸收峰，最大吸收峰为753 nm。

2）多酚类化合物标准曲线的绘制：精确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，于已标记好0、1、2、3、4、5、6、7号的25 mL棕色容量瓶中；再依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；最后用去离子水定容到25 mL；充分混匀，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。以0号作对照，于753 nm处测定不同浓度的没食子酸对应的吸光值。其中，0-7号标准样最终得到的浓度为0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3组重复，取平均值，绘制标准曲线，并得出回归方程。

3）样品水提取物中多酚类化合物的测定：将样品水提取物稀释10倍；精确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液体于已标记好0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中。其余步骤同上。做3组重复，以0号作对照，于753 nm处测定吸光度。取平均值，记录各组数据，绘制出吸光度随样品水提取物体积变化的曲线。在曲线上找到样品水提取物稀释10倍，取1 mL样品所得到的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得出样品水提取物的多酚类化合物的含量。

4）样品95%乙醇提取物中多酚类化合物的测定：精确吸取样品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已标记0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中，其他步骤同样品水提取物的测定步骤。记录各组数据，绘制出吸光度随样品95%乙醇提取物体积的变化曲线。在曲线上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所对应的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得到95%乙醇提取物的多酚类化合物的含量。

由水提取物与95%乙醇提取物分别测定的多酚类化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚类化合物的含量。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取所得体积

样品水提取物的总体积为81 mL，样品95%乙醇提取物的总体积为126 mL。根据样品的总体积计算多酚类化合物和黄酮类化合物的总量。

2.2 多酚类化合物结果分析

在400～900 nm范围内进行扫描，检测出最大吸收峰波长为753 nm。由以上数据及曲线（表1-表3；图1-图3）表明，多酚类化合物标准曲线的线性回归方程为：y= 100.500 0x+0.013 5（R2=0.999 3）。以没食子酸为标准品测定的多酚类化合物标准曲线呈现较好的线性关系。

样品水提取物稀释10倍后，测定多酚类化合物得到的线性回归方程为：y=0.325 2x-0.006 0 （R2=0.998 3）。则样品水提取物稀释10倍后，取1 mL测定的吸光度为0.319 2，由标准曲线得到的没食子酸浓度为0.003 0 mg/L，则样品水提取物的多酚类化合物总量为60.75 mg。样品95%乙醇提取物中多酚类化合物测定得到的线性回归方程为：y= 0.399 3x+0.045 5 （R2=0.993 4）。同样的可以计算出样品95%乙醇提取物中多酚类化合物总量为13.55 mg。可知多酚类化合物大多可溶于水，水溶性的多酚类化合物为醇溶性的4.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚类化合物为74.30 mg，即枸杞花中多酚类化合物含量约占1.49%。

3 小结与讨论

采摘的宁夏本地的枸杞花阴干后，对干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反复提取，并借用超声波（40 kHz）在50 ℃下提取50 min。得到的提取物经减压浓缩，真空抽滤等步骤，最终得到水相（样品水提取物为81 mL）和醇相（样品95%乙醇提取物为126 mL）两种提取物。采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为参照品，在753 nm处测定样品水提取物、95%乙醇提取物中多酚类化合物，得到两者含量分别为60.75 mg和13.55 mg，很显然水相中的多酚类化合物比醇相中的多，是其4.48倍，其中总多酚类化合物含量为74.30 mg，约占干枸杞花的1.49%。

参考文献：

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[8] 贝盏临，张 欣，曹君迈，等.枸杞花总黄酮的测定[J].湖北农业科学，2012，51（6）：1240-1241.

[9] 张 欣，曹君迈，贝盏临，等.枸杞花抗氧化作用的研究[J].江苏农业科学，2012，40（3）：301-303.

[10] 韩 菊，魏福祥.Folin-Ciocalteu比色法测定苹果渣中的多酚[J]. 食品科学，2010，31（4）：179-182.

[11] 李巨秀，王柏玉.福林-酚比色法测定桑葚中的总多酚[J].食品科学，2009，30（18）：292-295.

[12] 丁 明，钟冬莲.茶油中总酚的测定方法[J].浙江农业科学， 2010，30（6）：1369-1371.endprint

1.2.2多酚类化合物的测定 多酚类化合物的测定方法参照[10-12]，略有改动。

1）最大吸收波长的确定：精确称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，即得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。精确吸取0.05 mg/mL没食子酸标准溶液2 mL，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；充分混匀后，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。同时，以未加入没食子酸的溶液作为空白溶液，于紫外-可见分光光度计在400～900 nm下进行扫描。检测最大吸收峰，最大吸收峰为753 nm。

2）多酚类化合物标准曲线的绘制：精确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，于已标记好0、1、2、3、4、5、6、7号的25 mL棕色容量瓶中；再依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；最后用去离子水定容到25 mL；充分混匀，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。以0号作对照，于753 nm处测定不同浓度的没食子酸对应的吸光值。其中，0-7号标准样最终得到的浓度为0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3组重复，取平均值，绘制标准曲线，并得出回归方程。

3）样品水提取物中多酚类化合物的测定：将样品水提取物稀释10倍；精确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液体于已标记好0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中。其余步骤同上。做3组重复，以0号作对照，于753 nm处测定吸光度。取平均值，记录各组数据，绘制出吸光度随样品水提取物体积变化的曲线。在曲线上找到样品水提取物稀释10倍，取1 mL样品所得到的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得出样品水提取物的多酚类化合物的含量。

4）样品95%乙醇提取物中多酚类化合物的测定：精确吸取样品95%乙醇提取物溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于已标记0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中，其他步骤同样品水提取物的测定步骤。记录各组数据，绘制出吸光度随样品95%乙醇提取物体积的变化曲线。在曲线上找到1 mL 95%乙醇提取物溶液所对应的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得到95%乙醇提取物的多酚类化合物的含量。

由水提取物与95%乙醇提取物分别测定的多酚类化合物的含量可得出5 g枸杞干花粉末中含有的多酚类化合物的含量。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取所得体积

样品水提取物的总体积为81 mL，样品95%乙醇提取物的总体积为126 mL。根据样品的总体积计算多酚类化合物和黄酮类化合物的总量。

2.2 多酚类化合物结果分析

在400～900 nm范围内进行扫描，检测出最大吸收峰波长为753 nm。由以上数据及曲线（表1-表3；图1-图3）表明，多酚类化合物标准曲线的线性回归方程为：y= 100.500 0x+0.013 5（R2=0.999 3）。以没食子酸为标准品测定的多酚类化合物标准曲线呈现较好的线性关系。

样品水提取物稀释10倍后，测定多酚类化合物得到的线性回归方程为：y=0.325 2x-0.006 0 （R2=0.998 3）。则样品水提取物稀释10倍后，取1 mL测定的吸光度为0.319 2，由标准曲线得到的没食子酸浓度为0.003 0 mg/L，则样品水提取物的多酚类化合物总量为60.75 mg。样品95%乙醇提取物中多酚类化合物测定得到的线性回归方程为：y= 0.399 3x+0.045 5 （R2=0.993 4）。同样的可以计算出样品95%乙醇提取物中多酚类化合物总量为13.55 mg。可知多酚类化合物大多可溶于水，水溶性的多酚类化合物为醇溶性的4.48倍。5 g枸杞干花中含有的多酚类化合物为74.30 mg，即枸杞花中多酚类化合物含量约占1.49%。

3 小结与讨论

采摘的宁夏本地的枸杞花阴干后，对干枸杞花依次采用水、60%、85%、95%乙醇反复提取，并借用超声波（40 kHz）在50 ℃下提取50 min。得到的提取物经减压浓缩，真空抽滤等步骤，最终得到水相（样品水提取物为81 mL）和醇相（样品95%乙醇提取物为126 mL）两种提取物。采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为参照品，在753 nm处测定样品水提取物、95%乙醇提取物中多酚类化合物，得到两者含量分别为60.75 mg和13.55 mg，很显然水相中的多酚类化合物比醇相中的多，是其4.48倍，其中总多酚类化合物含量为74.30 mg，约占干枸杞花的1.49%。

参考文献：

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