HPLC法对凤冈锌硒茶中九种品质成分的同时测定

张俊英+冯发青+李霞+王兰兰+向丽萍+王奥

摘要：建立了基于高效液相色谱（HPLC）同时测定凤冈锌硒绿茶中7种儿茶素类物质：儿茶素（+C）、没食子儿茶素（GC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子酸（GA）和咖啡因（CAF）的方法。色谱条件为Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈、乙酸及EDTA溶液为流动相，梯度洗脱；柱温为35 ℃；检测波长为278 nm。结果表明，茶叶中各目标峰均达基线分离，线性关系良好，该方法简捷、准确、重现性好。

关键词：凤冈锌硒茶；儿茶素；没食子酸；咖啡因；HPLC

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4175-03

Simultaneous Determination of Nine Quality Ingredients in Zinc and Selenium

Tea of Fenggang with HPLC

ZHANG Jun-ying， FENG Fa-qing， LI Xia， WANG Lan-lan， XIANG Li-ping， WANG Ao

（Institute of Product Quality Inspection & Testing of Zunyi， Zunyi 563000， Guizhou， China）

Abstract： HPLC was used to simultaneously determine catechin（+C），（-）-gallocatechin （GC）， （-）-gallocatechin gallate （GCG）， L-epicatechin（EC），（-）-epigallocatechin（EGC），epigallocatechin gallate（EGCG），（-）-epicatechin gallate （ECG）， gallic acid （GA） and caffeine （CAF） in zinc and selenium tea of Fenggang. The analyses were made with a Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）. The mobile phase was mixture solution of acetonitrile， acetic acid and EDTA solution with the gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 278 nm. The column temperature was 35 ℃. The results showed that there was a good separation and linearity for all 9 compounds tested in zinc and selenium tea of Fenggang. It is indicated that the method was simple， feasible and reproducible.

Key words： zinc and selenium tea of Fenggang；catechins； gallic acid； caffeine； HPLC

儿茶素类化合物具有防治心血管疾病、预防癌症等功能[1，2]；咖啡因具有适度祛疲劳、兴奋神经的作用[3]；没食子酸具有抗菌，抗病毒、抗肿瘤等功效[4]，而且儿茶素、咖啡碱类物质还是决定茶叶色、香、味的重要成分，是茶汤滋味苦涩的主要因素之一[5]，也与茶叶品质密切相关。但值得注意的是，现行国家标准GB/T 8313-2008中对茶叶中儿茶素类物质的测定仅限于5种[6]，而且对国家标准规定以外的其他儿茶素类物质测定的研究较少[7，8]，缺乏以HPLC技术为基础同时测定茶叶中没食子酸、咖啡因和儿茶素等品质成分的研究[9-11]。因此，本研究以贵州特色地理标志保护产品凤冈锌硒茶为对象，建立并优化了一种基于HPLC对茶叶中没食子酸、咖啡因和儿茶素等9种品质成分的同时测定方法，以期更好地反映凤冈锌硒茶质量，并为其进一步的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2012～2013年，依据凤冈富锌富硒茶地理标志产地保护所界定的地域范围，在贵州省遵义市凤冈县田坝的3个茶园现场采摘、经过加工得到7个凤冈锌硒绿茶样品。所有样品均为独芽、依照凤冈富锌富硒茶加工工艺进行制作，样品经粉碎机粉碎、过20目筛后密封备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取样品0.200 0 g于离心管中，加入5 mL 70%的甲醇溶液，超声提取，于5 000 r/min离心5 min后收集上清液，重复提取一次，合并所得上清液。准确量取2.0 mL上清液至10 mL容量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得待测液。

1.2.2 标准溶液配置 将25 mL EDTA溶液（10 g/L）、25 mL抗坏血酸溶液（10 g/L）、50 mL乙腈、以去离子水定容至500 mL，制得混合溶液。

分别准确称取各标准品适量，以混合溶液溶解定容配制标准储备液，其浓度分别为：0.121 1 mg/mL（GA）、0.484 6 mg/mL（GC）、2.450 0 mg/mL（EGC）、1.098 0 mg/mL（+C）、2.014 0 mg/mL（CAF）、2.008 0 mg/mL（EGCG）、1.019 0 mg/mL（EC）、0.441 1 mg/mL（GCG）、2.002 0 mg/mL（ECG）。endprint

取上述储备液GA、GC、GCG各1.00 mL，EGC、CAF、EC、ECG各0.50 mL，EGCG 0.20 mL，+C 0.35 mL，以混合溶液溶解并定容至10 mL，即得混合标准溶液。

1.2.3 检测条件 美国Waters公司e2695高效液相色谱仪，流动相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L；流动相B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L。

色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱条件为：0～10 min（100% A），10～32 min（100%～80% A）；流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃，检测波长为278 nm；进样体积为10 μL。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

本研究考察了10、20、30、40、60 min共5个提取时间对茶叶中9种成分含量的影响。结果显示，当提取时间为30 min时，提取出茶叶中9种成分含量总和达到最大，所以选择最佳提取时间为30 min。

同时考察了以5 mL 70%的甲醇溶液超声30 min提取1、2、3次所得茶叶中9种成分含量总和，结果发现重复提取两次效果最佳，所以选择以5 mL 70%的甲醇溶液提取两次。

试验还考察超声30 min重复提取两次与GB/T 8313-2008中70 ℃水浴提取进行了对比，结果表明，超声30 min重复提取两次与70 ℃水浴提取10 min两种提取效果相当。但因超声提取操作简便，过程易于控制，所以选择超声取作为提取方式。

2.2 系统适用性试验

紫外光谱扫描结果显示，9种组分在278 nm处均有较强吸收，故设定检测波长为278 nm。标准品、供试品、空白溶液的色谱图如图1所示，标准品、供试品色谱图中的各目标峰分离度、峰型均较好，且无杂质干扰。

2.3 方法验证

2.3.1 线性方程 分别精密吸取混合标准溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加混合溶液稀释并定容至刻度，按上述色谱条件进行测定。以峰面积值（y）对进样量（x）进行线性回归，9种组分的线性回归方程、相关系数如表1所示，测定结果表明，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度、稳定性、重复性试验 精密吸取混合标准品溶液，连续进样6次，以峰面积计算RSD值。取同一样品待测液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样，记录各色谱峰峰面积，计算其RSD值。取相同样品，按优化后的方法制备6份待测液，计算测得的9种组分含量RSD值。精密度、稳定性及重复性试验计算RSD值结果如表2所示，结果表明，仪器精密度良好，供试品溶液在5 h内稳定，方法重复性良好。

2.3.3 加标回收率试验 采用标准加入法进行方法回收率试验，准确称取已知组分含量的茶叶样品1份，再加入一定量的标准品，按优化后的方法制备待测液，测定并计算回收率。加样回收率测定结果如表3所示，各组分的回收率均为96.36%～104.59%，说明该方法准确可靠。

2.4 样品测定

取各茶叶样品按前述方法制备待测液，以峰面积为指标，外标法定量，测定结果见表4。结果显示，9种品质成分在凤冈锌硒茶样品中均检出，且儿茶素类物质EGCG含量最高，GA含量最低。该方法能够有效的进行包括GC、GCG在内的茶叶中9种品质相关成分的同时测定。

3 小结与讨论

通过对供试品溶液制备方法的试验考察和对色谱条件的优化，建立了同时测定凤冈锌硒茶中儿茶素（GC、EGC、+C、EGCG、EC、GCG、ECG）、没食子酸（GA）和咖啡因（CAF）等9个成分的高效液相色谱方法。结果表明，各目标峰分离度、峰型均较好。通过线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率的系统性试验考察，表明该方法操作简单、快速，且测定效果良好，结果准确可靠。本方法在GB/T 8313-2008的基础上增加了GC和GCG两种儿茶素类物质的测定，同时对其提取工艺进行了改进，使得样品前处理更加方便快捷、提取过程更易于控制，为更加全面的反映凤冈锌硒茶品质提供了一种可行的方法，同时也为其他茶叶的品质成分研究提供了参考。

参考文献：

[1] 赵保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科学通报，2002，47（16）： 1206-1210.

[2] 焦蓓蓓.茶多酚的药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2009， 5（1）：131-133.

[3] 易超然，卫中庆.咖啡因的药理作用和应用[J].医学研究生学报，2005，18（3）：270-272.

[4] 江苏新药学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2000.

[5] 蒲晓亚，袁毅君，王廷璞，等.茶叶的主要呈味物质综述[J].天水师范学院学报，2011，31（2）：40-44.

[6] GB/T 8313-2008，茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S].

[7] 钟世安，周春山，李宇萍.反相高效液相色谱法同时测定茶叶中六种儿茶素组分的研究[J].理化检验，2003，39（9）：542-546.

[8] 刘小乔，李忠岐，高 静，等.茶多酚中儿茶素类的HPLC分析[J].光谱实验室，2012，29（5）：2611-2615.

[9] 高 俊，夏 涛，朱 博，等.HPLC-PDA对茶叶中茶氨酸、儿茶素和生物碱的同时分离检测研究[J].安徽农业大学学报， 2008，35（3）：324-328.

[10] 凌 云，赵云峰，李志军，等.茶叶及茶饮料中儿茶素和咖啡因的多组分HPLC分析方法[J].卫生研究，2005，34（2）：187-190.

[11] 李银花，李 娟，龚 雪，等.高效液相色谱法同时测定茶叶中8种儿茶素、3种嘌呤碱和没食子酸[J].食品科学，2011，32（18）： 214-217.endprint

取上述储备液GA、GC、GCG各1.00 mL，EGC、CAF、EC、ECG各0.50 mL，EGCG 0.20 mL，+C 0.35 mL，以混合溶液溶解并定容至10 mL，即得混合标准溶液。

1.2.3 检测条件 美国Waters公司e2695高效液相色谱仪，流动相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L；流动相B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L。

色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱条件为：0～10 min（100% A），10～32 min（100%～80% A）；流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃，检测波长为278 nm；进样体积为10 μL。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

本研究考察了10、20、30、40、60 min共5个提取时间对茶叶中9种成分含量的影响。结果显示，当提取时间为30 min时，提取出茶叶中9种成分含量总和达到最大，所以选择最佳提取时间为30 min。

同时考察了以5 mL 70%的甲醇溶液超声30 min提取1、2、3次所得茶叶中9种成分含量总和，结果发现重复提取两次效果最佳，所以选择以5 mL 70%的甲醇溶液提取两次。

试验还考察超声30 min重复提取两次与GB/T 8313-2008中70 ℃水浴提取进行了对比，结果表明，超声30 min重复提取两次与70 ℃水浴提取10 min两种提取效果相当。但因超声提取操作简便，过程易于控制，所以选择超声取作为提取方式。

2.2 系统适用性试验

紫外光谱扫描结果显示，9种组分在278 nm处均有较强吸收，故设定检测波长为278 nm。标准品、供试品、空白溶液的色谱图如图1所示，标准品、供试品色谱图中的各目标峰分离度、峰型均较好，且无杂质干扰。

2.3 方法验证

2.3.1 线性方程 分别精密吸取混合标准溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加混合溶液稀释并定容至刻度，按上述色谱条件进行测定。以峰面积值（y）对进样量（x）进行线性回归，9种组分的线性回归方程、相关系数如表1所示，测定结果表明，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度、稳定性、重复性试验 精密吸取混合标准品溶液，连续进样6次，以峰面积计算RSD值。取同一样品待测液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样，记录各色谱峰峰面积，计算其RSD值。取相同样品，按优化后的方法制备6份待测液，计算测得的9种组分含量RSD值。精密度、稳定性及重复性试验计算RSD值结果如表2所示，结果表明，仪器精密度良好，供试品溶液在5 h内稳定，方法重复性良好。

2.3.3 加标回收率试验 采用标准加入法进行方法回收率试验，准确称取已知组分含量的茶叶样品1份，再加入一定量的标准品，按优化后的方法制备待测液，测定并计算回收率。加样回收率测定结果如表3所示，各组分的回收率均为96.36%～104.59%，说明该方法准确可靠。

2.4 样品测定

取各茶叶样品按前述方法制备待测液，以峰面积为指标，外标法定量，测定结果见表4。结果显示，9种品质成分在凤冈锌硒茶样品中均检出，且儿茶素类物质EGCG含量最高，GA含量最低。该方法能够有效的进行包括GC、GCG在内的茶叶中9种品质相关成分的同时测定。

3 小结与讨论

通过对供试品溶液制备方法的试验考察和对色谱条件的优化，建立了同时测定凤冈锌硒茶中儿茶素（GC、EGC、+C、EGCG、EC、GCG、ECG）、没食子酸（GA）和咖啡因（CAF）等9个成分的高效液相色谱方法。结果表明，各目标峰分离度、峰型均较好。通过线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率的系统性试验考察，表明该方法操作简单、快速，且测定效果良好，结果准确可靠。本方法在GB/T 8313-2008的基础上增加了GC和GCG两种儿茶素类物质的测定，同时对其提取工艺进行了改进，使得样品前处理更加方便快捷、提取过程更易于控制，为更加全面的反映凤冈锌硒茶品质提供了一种可行的方法，同时也为其他茶叶的品质成分研究提供了参考。

参考文献：

[1] 赵保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科学通报，2002，47（16）： 1206-1210.

[2] 焦蓓蓓.茶多酚的药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2009， 5（1）：131-133.

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[5] 蒲晓亚，袁毅君，王廷璞，等.茶叶的主要呈味物质综述[J].天水师范学院学报，2011，31（2）：40-44.

[6] GB/T 8313-2008，茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S].

[7] 钟世安，周春山，李宇萍.反相高效液相色谱法同时测定茶叶中六种儿茶素组分的研究[J].理化检验，2003，39（9）：542-546.

[8] 刘小乔，李忠岐，高 静，等.茶多酚中儿茶素类的HPLC分析[J].光谱实验室，2012，29（5）：2611-2615.

[9] 高 俊，夏 涛，朱 博，等.HPLC-PDA对茶叶中茶氨酸、儿茶素和生物碱的同时分离检测研究[J].安徽农业大学学报， 2008，35（3）：324-328.

[10] 凌 云，赵云峰，李志军，等.茶叶及茶饮料中儿茶素和咖啡因的多组分HPLC分析方法[J].卫生研究，2005，34（2）：187-190.

[11] 李银花，李 娟，龚 雪，等.高效液相色谱法同时测定茶叶中8种儿茶素、3种嘌呤碱和没食子酸[J].食品科学，2011，32（18）： 214-217.endprint

取上述储备液GA、GC、GCG各1.00 mL，EGC、CAF、EC、ECG各0.50 mL，EGCG 0.20 mL，+C 0.35 mL，以混合溶液溶解并定容至10 mL，即得混合标准溶液。

1.2.3 检测条件 美国Waters公司e2695高效液相色谱仪，流动相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L；流动相B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA，以去离子水定容至1 L。

色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱条件为：0～10 min（100% A），10～32 min（100%～80% A）；流量为1.0 mL/min；柱温为35 ℃，检测波长为278 nm；进样体积为10 μL。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

本研究考察了10、20、30、40、60 min共5个提取时间对茶叶中9种成分含量的影响。结果显示，当提取时间为30 min时，提取出茶叶中9种成分含量总和达到最大，所以选择最佳提取时间为30 min。

同时考察了以5 mL 70%的甲醇溶液超声30 min提取1、2、3次所得茶叶中9种成分含量总和，结果发现重复提取两次效果最佳，所以选择以5 mL 70%的甲醇溶液提取两次。

试验还考察超声30 min重复提取两次与GB/T 8313-2008中70 ℃水浴提取进行了对比，结果表明，超声30 min重复提取两次与70 ℃水浴提取10 min两种提取效果相当。但因超声提取操作简便，过程易于控制，所以选择超声取作为提取方式。

2.2 系统适用性试验

紫外光谱扫描结果显示，9种组分在278 nm处均有较强吸收，故设定检测波长为278 nm。标准品、供试品、空白溶液的色谱图如图1所示，标准品、供试品色谱图中的各目标峰分离度、峰型均较好，且无杂质干扰。

2.3 方法验证

2.3.1 线性方程 分别精密吸取混合标准溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，加混合溶液稀释并定容至刻度，按上述色谱条件进行测定。以峰面积值（y）对进样量（x）进行线性回归，9种组分的线性回归方程、相关系数如表1所示，测定结果表明，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度、稳定性、重复性试验 精密吸取混合标准品溶液，连续进样6次，以峰面积计算RSD值。取同一样品待测液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样，记录各色谱峰峰面积，计算其RSD值。取相同样品，按优化后的方法制备6份待测液，计算测得的9种组分含量RSD值。精密度、稳定性及重复性试验计算RSD值结果如表2所示，结果表明，仪器精密度良好，供试品溶液在5 h内稳定，方法重复性良好。

2.3.3 加标回收率试验 采用标准加入法进行方法回收率试验，准确称取已知组分含量的茶叶样品1份，再加入一定量的标准品，按优化后的方法制备待测液，测定并计算回收率。加样回收率测定结果如表3所示，各组分的回收率均为96.36%～104.59%，说明该方法准确可靠。

2.4 样品测定

取各茶叶样品按前述方法制备待测液，以峰面积为指标，外标法定量，测定结果见表4。结果显示，9种品质成分在凤冈锌硒茶样品中均检出，且儿茶素类物质EGCG含量最高，GA含量最低。该方法能够有效的进行包括GC、GCG在内的茶叶中9种品质相关成分的同时测定。

3 小结与讨论

通过对供试品溶液制备方法的试验考察和对色谱条件的优化，建立了同时测定凤冈锌硒茶中儿茶素（GC、EGC、+C、EGCG、EC、GCG、ECG）、没食子酸（GA）和咖啡因（CAF）等9个成分的高效液相色谱方法。结果表明，各目标峰分离度、峰型均较好。通过线性范围、精密度、稳定性、重复性、回收率的系统性试验考察，表明该方法操作简单、快速，且测定效果良好，结果准确可靠。本方法在GB/T 8313-2008的基础上增加了GC和GCG两种儿茶素类物质的测定，同时对其提取工艺进行了改进，使得样品前处理更加方便快捷、提取过程更易于控制，为更加全面的反映凤冈锌硒茶品质提供了一种可行的方法，同时也为其他茶叶的品质成分研究提供了参考。

参考文献：

[1] 赵保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科学通报，2002，47（16）： 1206-1210.

[2] 焦蓓蓓.茶多酚的药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2009， 5（1）：131-133.

[3] 易超然，卫中庆.咖啡因的药理作用和应用[J].医学研究生学报，2005，18（3）：270-272.

[4] 江苏新药学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，2000.

[5] 蒲晓亚，袁毅君，王廷璞，等.茶叶的主要呈味物质综述[J].天水师范学院学报，2011，31（2）：40-44.

[6] GB/T 8313-2008，茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S].

[7] 钟世安，周春山，李宇萍.反相高效液相色谱法同时测定茶叶中六种儿茶素组分的研究[J].理化检验，2003，39（9）：542-546.

[8] 刘小乔，李忠岐，高 静，等.茶多酚中儿茶素类的HPLC分析[J].光谱实验室，2012，29（5）：2611-2615.

[9] 高 俊，夏 涛，朱 博，等.HPLC-PDA对茶叶中茶氨酸、儿茶素和生物碱的同时分离检测研究[J].安徽农业大学学报， 2008，35（3）：324-328.

[10] 凌 云，赵云峰，李志军，等.茶叶及茶饮料中儿茶素和咖啡因的多组分HPLC分析方法[J].卫生研究，2005，34（2）：187-190.

[11] 李银花，李 娟，龚 雪，等.高效液相色谱法同时测定茶叶中8种儿茶素、3种嘌呤碱和没食子酸[J].食品科学，2011，32（18）： 214-217.endprint