利用pET—20b克隆与表达多功能半纤维素酶

彭静静

摘要：将来源于嗜热厌氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus， JW200）的双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB） 构建到pET-20b（+）上，得到质粒pET-20b-xarB。将来源于疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）构建到pET-20b-xarB上，得到表达质粒pET-20b-xarB-xynA。将重组质粒pET-20b-xarB-xynA转入大肠杆菌Escherichia coli JM109（DE3）进行表达。SDS-PAGE结果显示，该重组酶的分子量为108 kDa，与理论值相符。

关键词：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纤维素酶；克隆；表达

中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

农业废弃物是指农业生产和农副产品加工后的剩余物，主要包括农作物或果树的秸秆或枝条、果实外壳、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化学成分是纤维素、半纤维素、木质素等，是亟待开发的重要可再生资源。我国每年秸秆产量达6亿t左右，目前大部分秸秆用于燃烧或者被废弃[1]。秸秆中半纤维素的含量占总干重的25%～50%，其化学结构较纤维素复杂，其彻底降解的产物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生产有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类溶剂或燃剂。

来自嗜热厌氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物进行测试，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分别为每毫克蛋白质180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉状嗜热丝孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所产生的木聚糖酶A（XynA）属于G/11家族，具有较好的热稳定性，在高温和碱性条件下有效且稳定，没有纤维素活性，具有工业化应用前景，且研究发现，该木聚糖酶优先降解高聚合度的木聚糖链，产物是不同聚合度的低聚木糖，不产生木单糖，这对于生产低聚木糖具有很好的应用价值[3]。同时使用多种克隆的特异水解某一多糖结构的水解酶来降解木聚糖，清洁高效，但工序复杂，成本高。在不改变酶自身优良性质的条件下，如果将有关的水解酶融合串联成一个具有多种水解酶活性的多功能酶，或通过融合标签回收重复利用酶，来提高融合酶的综合效率，这将大大简化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用带有T7强启动子的pET系列表达载体，将嗜热厌氧乙醇菌的双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）进行基因融合，得到多功能酶的融合表达质粒pET-20b-xarB-xynA。通过蛋白质工程构建多功能半纤维素酶（XarB-XynA）来促进生物转化，为酶法降解半纤维素的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（购自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固体培养基添加终浓度为2%的琼脂粉。

含有双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重组质粒pHsh-xarB、含有疏棉状嗜热丝孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的质粒pHsh-xynA2由本实验早期构建并保存。质粒pET-20b（+） （购自Novagen 公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 基因组提取 DNA 操作采用分子克隆技术标准方法进行。质粒转化采用电转化方法进行，质粒和PCR产物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）进行纯化。

1.2.2 基因克隆 根据GenBank中嗜热厌氧乙醇菌（JW200）双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登录号AF135015）设计引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3，下划线为 XbaⅠ酶切位点。xarB-C：5- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3，下划线为 EcoR V酶切位点。以提取的重组质粒pHsh-xarB为模板， 利用相应的上下游引物扩增双活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，为提高所扩增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶对模板进行扩增。具体方法见参考文献[2，3]。所得质粒命名为pET-20b-xarB，双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

根据GenBank中疏棉状嗜热丝孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登录号U35436）以及本试验优化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重组质粒pHsh-xynA2为模板，设计引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3，下划线为EcoR V酶切位点。xynA-C：5-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3，下划线为为 XhoⅠ酶切位点。

以pHsh-xynA2为模板，利用相应的上下游引物扩增基因xynA，为提高所扩增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶对模板进行扩增。具体方法见参考文献[2，3]。PCR扩增产物电泳检测正确后纯化，将pET-20b-xarB质粒和PCR扩增纯化后的DNA片段分别用EcoR V和XhoⅠ双酶切，割胶回收DNA片段和载体酶切产物，乙醇沉淀浓缩，16 ℃下连接6～12 h。连接液转化至E.coli DH10B，挑取阳性克隆，提取质粒用EcoR V和XhoⅠ内切酶酶切验证，得到重组质粒pET-20b-xarB-xynA，双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

1.2.3 重组蛋白的表达与纯化 重组质粒pET-20b-xarB-xynA电转化到宿主细胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重组单菌落接种于含100 μg/mL的氨苄青霉素的 LB 培养液中培养，至OD600 nm为0.6～0.8，加IPTG至浓度为0.8 mmol/L，继续培养6 h后，离心收集菌体。用50 mmol/L pH为7.5的 Tris-HCl 缓冲液洗涤细胞2次，并用相同缓冲液重悬细胞，置于冰水浴中用超声波破碎仪破碎细胞， 超声条件为50 Hz×15 s×8， 细胞碎片于12 000 r/min 离心10 min，去除上清液即为粗酶液。将粗酶液在60 ℃热处理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min去除变性蛋白。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET-20b-xarB的构建

根据GenBank中嗜热厌氧乙醇菌（JW200）双活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重组质粒pHsh-xarB为模板，用引物xarB-N和xarB-C进行PCR扩增，结果如图1A所示，扩增出来的片段与基因实际大小2 355 bp是相符的。

PCR产物验证正确后过柱纯化，并用XbaⅠ和EcoR V进行双酶切，酶切后的pET-20b（+）质粒进行连接，得到重组质粒pET-20b-xarB。重组质粒经EcoR V单酶切后释放出6 000 bp大小的条带，经XbaⅠ和EcoR V双酶切后，释放出2 300 bp大小的条带，与基因大小一致，同时在3 700 bp处有一条带和pET-20b（+）载体酶切后条带大小一致，结果如图1B所示，测序结果表明基因xarB序列与公布的序列完全一致。

2.2 重组质粒pET-20b-xarB-xynA的构建

以重组质粒pHsh-xynA2为模板，以xynA-N和xynA-C为引物进行PCR扩增，将纯化后的DNA片段与pET-20b-xarB分别用EcoR V和XhoⅠ进行

双酶切，连接后挑选阳性克隆，得到重组质粒pET-20b-xarB-xynA。重组质粒经XhoⅠ单酶切后释放出6 600 bp大小的条带，经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，释放出2 955 bp大小的条带，与基因（xarB+xynA）大小一致，同时在3 700 bp处有一条带和pET-20b（+）载体酶切后条带大小一致，酶切结果如图2所示。

2.3 重组多功能半纤维素酶的表达及检测

将重组质粒pET-20b-xarB-xynA电转化到宿主细胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重组单菌落接种于含100 g/mL 的氨苄青霉素的 LB 培养液中培养至OD600 nm为0.6～0.8，加IPTG至浓度为0.8 mmol/L，继续培养6 h 后，离心收集菌体。以pET-20b（+）转化产物为对照，SDS-PAGE分析结果表明，重组菌均能产生约108 kDa的特异条带，结果如图3所示，与预期的蛋白质相对分子量大小一致。

3 讨论

虽然已有多种木聚糖酶被提纯或基因克隆，并且这些酶在底物特异性热稳定性及酶反应的底物范围等性能方面都各有优势，但是相对于半纤维素结构及其降解的复杂特点，仅靠自然菌种所产酶的单一优良性质仍不能实现农业废弃物的高效利用，也不能满足工业生产的需要。重组酶XarB这个双重活性的酶可与木聚糖酶协同作用彻底降解阿拉伯木聚糖，是工业酶制剂的理想酶源，从而为构建多功能半纤维素融合酶提供一个很好的酶材料。endprint

本研究将来源于嗜热厌氧乙醇菌双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）同时构建到pET-20b（+）上，得到融合酶表达质粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大肠杆菌里面成功表达。双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的杂合酶在降解农业废弃物方面有着明显的优势，将有助于提高农业废弃物的降解效率。

参考文献：

[1] BASTAWDE K B. Xylan structure， microbial xylanase， and their mode of action[J]. World J Microbiol Biotechnol，1992，8：353-368.

[2] YIN E K， LE Y L， PEI J J， et al. High-level expression of the xylanase from Thermomyces lanuginosus in Escherichia coli [J]. World J Microbiol Biotechnol， 2008， 24： 275-280.

[3] XUE Y M， LU C， MAO Z G， et al. Cloning and expression of arabinofuranosi-dase/xylosidase gene of Thermoanaerobacter ethanolicus in Escherichia coli and stability of expression products[J]. J China Agri Univ， 2003，8（5）：9-13.

[4] LEVASSEUR A， NAVARRO D， PUNT P J， et al. Construction of engineered bifunctional enzymes and their overproduction in Aspergillus niger for improved enzymatic tools to degrade agricultural by-products[J]. Appl Environ Microbiol， 2005， 71（12）： 8132-8140.

[5] SHENG Y J， LI S， GOU X J， et al. The hybrid enzymes from α-aspartyl dipeptidase and L-aspartase[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 331（1）： 107-124.

[6] LU P， FENG M G， LI W F， et al. Construction and characterization of a bifunctional fusion enzyme of Bacillus-sourced β-glucanase and xylanase expressed in Escherichia coli [J]. FEMS Microbiol Lett， 2006， 261（2）： 224-230.endprint

本研究将来源于嗜热厌氧乙醇菌双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）同时构建到pET-20b（+）上，得到融合酶表达质粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大肠杆菌里面成功表达。双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的杂合酶在降解农业废弃物方面有着明显的优势，将有助于提高农业废弃物的降解效率。

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本研究将来源于嗜热厌氧乙醇菌双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）同时构建到pET-20b（+）上，得到融合酶表达质粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大肠杆菌里面成功表达。双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的杂合酶在降解农业废弃物方面有着明显的优势，将有助于提高农业废弃物的降解效率。

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