酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性分析

范亚军+倪秀珍

摘要：以瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）的豌豆（Pisum sativum L.）为试验材料，提取豌豆中可溶性总蛋白质，利用Western blot方法检测目的蛋白质，结果表明豌豆可成功表达aFGF；采用肝素亲和柱层析法分离目的蛋白aFGF，并用MTT法检测aFGF的生物学活性，结果表明豌豆中表达的酸性成纤维细胞生长因子具有促细胞分裂活性。

关键词：豌豆（Pisum sativum L.）；酸性成纤维细胞生长因子；分离；纯化；活性

中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4211-03

Separation， Purification and Bioactivity of Acidic

Fibroblast Growth Factor

FAN Ya-jun， NI Xiu-zhen

（Department of Biology， Changchun Normal University， Changchun 130032， China）

Abstract： The pea（Pisum sativum L.） plants expressing the foreign protein aFGF were used to extract the total soluble proteins. Western blot was performed to identified the aFGF protein. Heparin-affinity chromatography was used to separate and purify the aFGF. The bioactivity of the aFGF purified was analyzed by MTT. The result of western blot confirmed that the exogenous protein aFGF was expressed and purified successfuly from pea plants. The MTT results showed that the pea plants derived aFGF had the mitogentic activity.

Key words： pea（Pisum sativum L.）； aFGF； separation；purification； bioactivity

酸性成纤维细胞生长因子（Acidic fibroblast growth factor，aFGF）是一种重要的有丝分裂原，在胚胎发育期间能够促进细胞分裂、增殖并参与细胞的迁移与分化[1，2]。有研究表明，aFGF可以通过促进溃疡底部血管增生而使溃疡得以快速修复，另外在受损的大脑皮质中内源性的酸性成纤维细胞生长因子及其受体表达水平均有提高，这说明aFGF在伤口愈合、神经系统的保护及再生过程中具有重要作用[3，4]。基于aFGF在机体发育及多种伤病治疗中的功能，选择高效、安全的生产平台表达酸性成纤维细胞生长因子对基础研究及医疗方面均具有重要意义，而利用植物作为生产平台瞬时表达药用蛋白质是当前生物技术领域的一个研究热点[5-9]，本研究以瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆（Pisum sativum L.）为试验材料，提取植物可溶性总蛋白质，利用肝素亲和柱层析法分离了外源蛋白质aFGF，并对目的蛋白质的生物学活性进行了分析，为研究酸性成纤维细胞生长因子提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆种子购买于长春市市场，瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆植株由长春师范大学分子生物学实验室构建完成，小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3细胞）由本实验室保存。

肝素琼脂糖凝胶（Heparin SepharoseTM CL-6B）购自北京鼎国生物技术有限公司，Microcon YM-10超滤管购自美国Millipore公司，蛋白质杂交所用二抗-辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司，低分子量蛋白质预染Marker购自北京鼎国生物技术发展中心，化学发光检测试剂盒Super Singnal West Pico Trial Kit购自Pierce公司，IMDM培养基、标准品aFGF购自美国Sigma-Aldrich公司。

蛋白质磷酸盐（PBS）提取缓冲液配制：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO4、0.27 g KH2PO4、pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 豌豆可溶性总蛋白质的提取及检测 称取瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆植株0.1 g充分研磨，加入100 μL预冷的蛋白质PBS提取缓冲液于冰上充分溶解蛋白质2～3 h，4 ℃ 12 000 r/min离心，得到上清液备用。目的蛋白质电泳后进行转膜处理，用5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜于4 ℃过夜反应，次日洗膜后加入aFGF抗体（按体积比1∶500稀释），室温下轻轻混合90 min后使用PBST（1 L PBS加入2 mL的Tween 20）洗膜，加入用PBST缓冲液稀释（1∶5 000）的二抗溶液，室温轻轻混合反应1 h后洗膜并进行显色、压片处理。

1.2.2 目的蛋白质的分离纯化及蛋白质杂交检测 采用肝素亲和层析法分离纯化目的蛋白质。首先用去离子水多次冲洗层析柱柱体，并用结合缓冲液（10 mmol/L PBS、0.15 mol/L NaCl，pH 7.4）对柱体进行平衡，将豌豆植物蛋白质与Heparin SepharoseTM CL-6B混合后置于冰上匀浆混合2 h，将混合后的液体缓慢加入柱中静置30～40 min后，用10倍体积的结合缓冲液洗脱杂蛋白，配置不同盐浓度的PBS缓冲液（0.5、0.8、1.0、1.5 mol/L NaCl）进一步洗去杂蛋白，收集洗脱液进行电泳并对蛋白质进行杂交检测。endprint

1.2.3 目的蛋白质的脱盐处理 将洗脱得到的目的蛋白质加入到Microcon YM-10超滤管柱中14 000 r/min离心40 min，并将离心后的Microcon YM-10柱子倒置于新的离心管中加入50 μL PBS缓冲液，1 000 r/min离心10 min得到脱盐后的目的蛋白质。

1.2.4 MTT法检测目的蛋白质aFGF的促细胞分裂活性 将培养后的NIH3T3细胞用胰酶消化，并用不含血清的IMDM培养基调节细胞浓度为5×104 个/mL，将稀释后的细胞均匀加入96孔板，每孔100 μL置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h。用蛋白质PBS缓冲液将标准品aFGF和植物中表达纯化的样品（aFGF）稀释成不同浓度梯度（125、250、375、500、625 ng/mL），并以蛋白质PBS缓冲液作为阴性对照，将不同浓度aFGF样品加入培养后的细胞中，每个梯度4次重复，加样后于37 ℃再次培养24 h，次日每孔加入5 mg/mL的外源四甲基偶氮唑盐（MTT）10 μL，37 ℃培养4～6 h后去掉上清液，加入溶解液二甲基亚砜（DMSO）每孔100 μL，震荡混匀后于波长570 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 目的蛋白质的提取和鉴定

根据植物蛋白质表达特点，在接种后12～14 d提取豌豆植株可溶性总蛋白质，并对目的蛋白质进行Western blot检测，杂交结果表明目的蛋白质酸性成纤维细胞生长因子在豌豆植株中成功表达，结果如图1所示。

2.2 目的蛋白质的分离纯化及杂交检测

研究表明，肝素与酸性成纤维细胞生长因子能够特异性结合[10]。通过肝素亲和柱层析法从豌豆植株总蛋白质中分离纯化目的蛋白质aFGF，通过不同盐浓度的PBS缓冲液洗脱，最终在含1.5 mol/L NaCl的PBS缓冲液中得到目的蛋白质，分离结果如图2 a所示。通过Western blot方法对所得到的蛋白质进行检测，以标准品aFGF为阳性对照，杂交结果表明从豌豆植株中成功纯化出外源蛋白质aFGF，结果如图2 b所示。

2.3 目的蛋白质活性分析

利用MTT法检测豌豆植株表达的aFGF的生物学活性，以aFGF标准品及PBS缓冲液分别作为阳性及阴性对照，结果表明豌豆植物表达的aFGF具有明显的促细胞分裂活性，在终浓度500 ng/mL时活性最高，结果如图3所示。

3 小结与讨论

利用植物系统表达药用蛋白质具有重要的发展及应用前景。由于植物表达系统相较于动物及微生物表达系统具有更高的安全性，因此近年来受到广泛的关注，而作为良好的生物反应器的基本条件是该体系能够成功表达外源蛋白质并且能够保证外源蛋白质的生物学活性。本研究以肝素亲和层析法分离纯化了豌豆植株中表达的外源蛋白质aFGF，并对其生物活性进行了检测。肝素是一种黏多糖，可以作为亲和柱层析中的吸附剂，研究表明酸性成纤维细胞生长因子是一种可以与肝素特异性亲和的蛋白质，当豌豆植株可溶性总蛋白质与肝素混合后二者发生特异性结合，通过不同盐离子浓度的缓冲液可以将非特异性结合的杂蛋白质洗脱掉[11]。本研究在含1.5 mol/L NaCl的PBS缓冲液中得到目的蛋白质，试验过程中发现混合液在亲和柱中静置的时间是影响目的蛋白质洗脱的关键条件，一般静置30 min左右可得到较高浓度的目的蛋白质。

MTT法是检测细胞活性常用的一种方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源四甲基偶氮唑盐（MTT）转化成蓝紫色甲瓒颗粒并沉积在细胞中，二甲基亚砜（DMSO）可将细胞中的甲瓒颗粒溶解，其吸光度（OD）值与活细胞数量呈正相关。酸性成纤维细胞生长因子具有促细胞分裂活性，在细胞中加入aFGF可提高细胞分裂速度，增加细胞数量，利用MTT法可检测aFGF的促细胞分裂活性。本试验结果表明，豌豆植株中表达的酸性成纤维细胞生长因子具有促细胞分裂活性，豌豆是一种良好的表达药用蛋白质的生物反应器。

参考文献：

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