外植体预培养时间对番茄外源基因转化的影响

李猷+尹蕾+唐凯悦+律凤霞

摘要：以番茄叶片为外植体，含有烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的工程农杆菌LBA4404为外源基因转化的双元载体，通过农杆菌叶盘法将外源基因转入番茄，转化前将番茄叶片进行不同时间预培养，研究外植体预培养时间对外源基因转化率的影响。结果表明，最适宜的预培养时间为32～48 h，番茄外植体转化率均达到70%以上。

关键词：番茄；烟草花叶病毒；预培养时间；转化率

中图分类号：S641.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4208-03

Effects of Pre-culture Time of Explants on the Exogenous Gene

Transformation in Tomato

LI You，YIN Lei，TANG Kai-yue，L？譈 Feng-xia

（Department of Biology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China）

Abstract： The leaves of tomato were used as explants and the Agrobacterium （LBA4404） was used as binary vector containing tobacco mosaic virus replicase gene（TMV-rep）， the pre-culture time before transformation was optimized. The results showed that the pre-culture time had significant effects on transgenic rate. The optimal pre-culture time was 32～48 hours，with transformation rate of more than 70%.

Key words：tomato；tobacco mosaic virus；pre-culture time； transgenic rate

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，营养丰富，味道鲜美。随着番茄种植区域和面积的不断扩大，病虫害成为影响番茄产量和品质的重要因素，造成的损失可达50%～100%[1]。病毒病是番茄的主要病害之一，每年造成番茄不同程度减产。危害番茄的病毒主要有烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、黄瓜卷叶病毒（TYL2CV）、苜蓿花叶病毒（AIMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）等[2]。可以通过常规杂交或回交等手段，获得综合性状表现优良且抗病的番茄品种，但常规育种手段在提高番茄抗病性方面进展速度有限，而以病毒来源的基因介导抗性所取得的成就较大。目前，番茄抗病毒病基因工程培育出了能稳定遗传的抗病毒植株，除外壳蛋白基因外，在番茄上主要采用卫星RNA基因、反义RNA基因等方法获得抗病毒番茄。通过RNA干扰技术获得的抗病毒转基因植物符合人们对生物安全性的高要求，但这种技术在番茄上的应用不多[3-5]。尤其是RNA干扰外源基因载体对番茄转化时，转化率成为限制转化成功的主要因素之一[3-5]。本试验以含有烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的工程农杆菌介导，将外源基因向番茄中转化，以番茄叶片为外植体，通过不同时间的外植体预培养后再进行常规基因转化，筛选外源基因转化体系的最佳外植体预培养时间[6-11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄种子：购于牡丹江市种子商店。

基因双元载体工程菌：含烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的农杆菌LBA4404，黑龙江省烟草科学研究所中心实验室提供。诱导愈伤组织及芽分化的培养基为MS培养基（其中添加0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）。

1.2 药剂和仪器

药剂：奈乙酸（NAA）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、卡那霉素（Kan）、羧苄青霉素（cb）、琼脂粉、0.1%升汞、无水乙醇等，均为分析纯。

仪器：日立Z-3000型紫外分光光度仪；美国BECKMAN高速冷冻离心机；水浴锅；天平；电泳仪；培养箱等。

1.3 试验方法

1.3.1 无菌材料的准备 取番茄种子2 g，放入无菌三角瓶中，先用75%乙醇进行表面消毒，再用消毒水（5%的漂白粉配制）的过滤液浸泡30 min。用无菌水冲洗9～10次，将冲洗干净的种子放在无菌纸上，将水分吸干，小心放置在1/2MS培养基上，28 ℃培养室光照培养。7～10 d后番茄种子发芽， 长出小叶芽，将叶芽剪出伤口，平铺在MS（含有0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）培养基中，培养室内光照培养7～8 d。愈伤组织长出后，10～15 d转入诱导生根培养基中，20 d左右可分化出番茄植株，25 d后从培养皿中取出，放在三角瓶中培养待用。

1.3.2 无菌番茄叶片预培养及侵染 将培养好的无菌番茄幼苗按叶盘法进行基因转化前预培养，即将无菌番茄苗叶片剪成四周有伤口的叶盘，正面朝上摆在有MS固体培养基的培养皿上，按试验设计的不同预培养时间（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h）放入26 ℃培养室内光照预培养。

工程菌侵染预培养番茄具体过程：

1）取低温保存含TMV-rep基因的农杆菌LBA4404，在YEB固体培养基[含50 mg/L Kan和50 mg/L利褔平（Rif）]低于28 ℃培养2 d。挑取单菌落接种于20 mL YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28 ℃震荡（150 r/min）培养2～3 d。endprint

2）菌液生长到OD600 nm为0.3～0.7时，取25～30 mL倒入无菌离心管中，于4 ℃下5 000 r/min离心5 min，去掉上清液，用MS液体培养基将附在离心管壁上的菌液悬浮下来，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min摇床内继续培养。

3）将摇床中的菌液取出，倒入事先放有不同预培养时间番茄叶片的无菌培养皿中，轻微摇匀，浸泡5～8 min。倒出菌液，将叶片夹出在吸水纸（无菌纸）上吸干表面的水分，放在MS液体培养基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸湿的无菌纸上，正面向上，再用无菌纸表面覆盖一层，用MS液体共培养基封口，放入22 ℃培养箱暗培养。

4）培养3 d后，将材料分别转至1号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），伤口与培养基充分接触，27 ℃下光照培养。

5）培养10～15 d统计分化芽数，30 d左右转至2号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）继续观察叶芽的变化，记录叶芽黄化情况，根据黄化结果计算不同预培养时间番茄外植体的转化率。

转化率=未黄化的叶芽数/叶芽总数×100%

2 结果与分析

2.1 番茄愈伤组织培养

含烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的农杆工程菌LBA4404在构建过程中，添加了抗卡那霉素基因，转化的番茄细胞会表现出对培养基中卡那霉素的抗性，故筛选培养基以卡那霉素浓度为选择压力。

从图1可以看出，侵染后经暗培养的番茄叶片转入1号筛选培养基后，叶片明显膨大，叶边缘伤口处形成大量愈伤组织。1号筛选培养基中羧苄青霉素的浓度较高为500 mg/L，以抑菌为主；而卡那霉素的浓度只有50 mg/L，以筛选转化细胞为辅。所以叶缘伤口处愈伤组织包含转化细胞和非转化细胞，且数量较多。

由图2可知，番茄愈伤组织转入2号筛选培养基后，叶缘的愈伤组织出现小部分黄化，因为2号筛选培养基在1号培养基抑菌效果的基础上降低了羧苄青霉素的浓度，为250 mg/L。减轻羧苄青霉素对愈伤组织生长的抑制作用；卡那霉素的浓度增加到100 mg/L，增加了对非转化细胞的筛选压力。少量非转化细胞在较高的卡那霉素浓度下生长受到抑制，表现为细胞叶绿素减少，叶片愈伤细胞黄化，达到了筛选目的。

由图3可知，2号培养基筛选后的转化细胞不受卡那霉素浓度增加的影响，经过一段时间的培养出现生长正常的绿色分化芽，同时还有少量已经分化的芽在后期表现出黄化现象，是非转化细胞分化后受培养基中高浓度卡那霉素的持续抑制产生的结果。可根据分化芽的黄化数量计算转化率。

2.2 不同预培养时间对番茄外植体转化率的影响

从表1可以看出，预培养8 h的番茄外植体转化率与对照相比有所增加，但增加幅度不大。预培养32～48 h番茄外植体转化率与对照相比明显增加，其转化率均大于70%，差异均达极显著水平；当预培养时间超过48 h后，转化率大幅度下降，预培养时间达到56 h时转化率为0，说明此时番茄叶芽伤口可能已经愈合，这时菌液浸泡叶芽，工程菌细胞质粒中的T-DNA已不能向番茄细胞中转移。

3 小结

本试验结果表明，农杆菌介导的外源基因转化过程中，不经预培养的番茄外植体经叶盘法转化，转化率相对较高，达到41.67%。在不同预培养时间内，最适宜的预培养时间为32～48 h，番茄外植体转化率大幅度提高。番茄外植体经32～48 h的预培养后再进行常规的转基因操作，此时工程菌细胞对叶芽边缘的细胞伤口多数形成初愈伤，细胞完整吸附效果好，能明显提高T-DNA区携带的外源目的基因向植物基因组转化的成功率。

参考文献：

[1] 沈福弟，沈进高，孙 军，等.番茄主要病虫害防治技术[J].上海蔬菜，2009（5）：72-73.

[2] 李 慧.加工番茄主要病虫害的发生与防治对策[J].农村科技， 2008（4）：41.

[3] 周静亚，徐忠传，张保龙，等.AP70抗病基因转化番茄的研究[J]. 安徽农业科学，2008，36（13）：5323-5324.

[4] 王全华，王秀峰.番茄抗病基因工程育种研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2003，34（4）： 600-604.

[5] 赵 爽，雷建军，陈国菊，等.番茄抗病毒基因工程研究进展[J]. 生命科学研究，2007，41（11）：83-86.

[6] 律凤霞，潘永明，郭兆奎.外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达[J].西北植物学报，2009，29（10）：1962-1966.

[7] 律凤霞，郭兆奎，颜培强，等.TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建[J].植物研究，2008，28（3）：310-314.

[8] 潘永明.根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化[J].北方园艺，2010（18）：142-144.

[9] WANG Y H， MOSEBACH C M， KIBBEY A S， et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep，2009，27（4）： 454-461.

[10] EOM H， LEE C G， JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta，2006，223（6）：1231-1242.

[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint

2）菌液生长到OD600 nm为0.3～0.7时，取25～30 mL倒入无菌离心管中，于4 ℃下5 000 r/min离心5 min，去掉上清液，用MS液体培养基将附在离心管壁上的菌液悬浮下来，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min摇床内继续培养。

3）将摇床中的菌液取出，倒入事先放有不同预培养时间番茄叶片的无菌培养皿中，轻微摇匀，浸泡5～8 min。倒出菌液，将叶片夹出在吸水纸（无菌纸）上吸干表面的水分，放在MS液体培养基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸湿的无菌纸上，正面向上，再用无菌纸表面覆盖一层，用MS液体共培养基封口，放入22 ℃培养箱暗培养。

4）培养3 d后，将材料分别转至1号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），伤口与培养基充分接触，27 ℃下光照培养。

5）培养10～15 d统计分化芽数，30 d左右转至2号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）继续观察叶芽的变化，记录叶芽黄化情况，根据黄化结果计算不同预培养时间番茄外植体的转化率。

转化率=未黄化的叶芽数/叶芽总数×100%

2 结果与分析

2.1 番茄愈伤组织培养

含烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的农杆工程菌LBA4404在构建过程中，添加了抗卡那霉素基因，转化的番茄细胞会表现出对培养基中卡那霉素的抗性，故筛选培养基以卡那霉素浓度为选择压力。

从图1可以看出，侵染后经暗培养的番茄叶片转入1号筛选培养基后，叶片明显膨大，叶边缘伤口处形成大量愈伤组织。1号筛选培养基中羧苄青霉素的浓度较高为500 mg/L，以抑菌为主；而卡那霉素的浓度只有50 mg/L，以筛选转化细胞为辅。所以叶缘伤口处愈伤组织包含转化细胞和非转化细胞，且数量较多。

由图2可知，番茄愈伤组织转入2号筛选培养基后，叶缘的愈伤组织出现小部分黄化，因为2号筛选培养基在1号培养基抑菌效果的基础上降低了羧苄青霉素的浓度，为250 mg/L。减轻羧苄青霉素对愈伤组织生长的抑制作用；卡那霉素的浓度增加到100 mg/L，增加了对非转化细胞的筛选压力。少量非转化细胞在较高的卡那霉素浓度下生长受到抑制，表现为细胞叶绿素减少，叶片愈伤细胞黄化，达到了筛选目的。

由图3可知，2号培养基筛选后的转化细胞不受卡那霉素浓度增加的影响，经过一段时间的培养出现生长正常的绿色分化芽，同时还有少量已经分化的芽在后期表现出黄化现象，是非转化细胞分化后受培养基中高浓度卡那霉素的持续抑制产生的结果。可根据分化芽的黄化数量计算转化率。

2.2 不同预培养时间对番茄外植体转化率的影响

从表1可以看出，预培养8 h的番茄外植体转化率与对照相比有所增加，但增加幅度不大。预培养32～48 h番茄外植体转化率与对照相比明显增加，其转化率均大于70%，差异均达极显著水平；当预培养时间超过48 h后，转化率大幅度下降，预培养时间达到56 h时转化率为0，说明此时番茄叶芽伤口可能已经愈合，这时菌液浸泡叶芽，工程菌细胞质粒中的T-DNA已不能向番茄细胞中转移。

3 小结

本试验结果表明，农杆菌介导的外源基因转化过程中，不经预培养的番茄外植体经叶盘法转化，转化率相对较高，达到41.67%。在不同预培养时间内，最适宜的预培养时间为32～48 h，番茄外植体转化率大幅度提高。番茄外植体经32～48 h的预培养后再进行常规的转基因操作，此时工程菌细胞对叶芽边缘的细胞伤口多数形成初愈伤，细胞完整吸附效果好，能明显提高T-DNA区携带的外源目的基因向植物基因组转化的成功率。

参考文献：

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[4] 王全华，王秀峰.番茄抗病基因工程育种研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2003，34（4）： 600-604.

[5] 赵 爽，雷建军，陈国菊，等.番茄抗病毒基因工程研究进展[J]. 生命科学研究，2007，41（11）：83-86.

[6] 律凤霞，潘永明，郭兆奎.外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达[J].西北植物学报，2009，29（10）：1962-1966.

[7] 律凤霞，郭兆奎，颜培强，等.TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建[J].植物研究，2008，28（3）：310-314.

[8] 潘永明.根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化[J].北方园艺，2010（18）：142-144.

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[10] EOM H， LEE C G， JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta，2006，223（6）：1231-1242.

[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint

2）菌液生长到OD600 nm为0.3～0.7时，取25～30 mL倒入无菌离心管中，于4 ℃下5 000 r/min离心5 min，去掉上清液，用MS液体培养基将附在离心管壁上的菌液悬浮下来，倒入三角瓶中，27 ℃ 220 r/min摇床内继续培养。

3）将摇床中的菌液取出，倒入事先放有不同预培养时间番茄叶片的无菌培养皿中，轻微摇匀，浸泡5～8 min。倒出菌液，将叶片夹出在吸水纸（无菌纸）上吸干表面的水分，放在MS液体培养基（含0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA）浸湿的无菌纸上，正面向上，再用无菌纸表面覆盖一层，用MS液体共培养基封口，放入22 ℃培养箱暗培养。

4）培养3 d后，将材料分别转至1号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +50 mg/L Kan+500 mg/L cb），伤口与培养基充分接触，27 ℃下光照培养。

5）培养10～15 d统计分化芽数，30 d左右转至2号筛选培养基（MS固体培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA +100 mg/L Kan+250 mg/L cb）继续观察叶芽的变化，记录叶芽黄化情况，根据黄化结果计算不同预培养时间番茄外植体的转化率。

转化率=未黄化的叶芽数/叶芽总数×100%

2 结果与分析

2.1 番茄愈伤组织培养

含烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-rep）基因的农杆工程菌LBA4404在构建过程中，添加了抗卡那霉素基因，转化的番茄细胞会表现出对培养基中卡那霉素的抗性，故筛选培养基以卡那霉素浓度为选择压力。

从图1可以看出，侵染后经暗培养的番茄叶片转入1号筛选培养基后，叶片明显膨大，叶边缘伤口处形成大量愈伤组织。1号筛选培养基中羧苄青霉素的浓度较高为500 mg/L，以抑菌为主；而卡那霉素的浓度只有50 mg/L，以筛选转化细胞为辅。所以叶缘伤口处愈伤组织包含转化细胞和非转化细胞，且数量较多。

由图2可知，番茄愈伤组织转入2号筛选培养基后，叶缘的愈伤组织出现小部分黄化，因为2号筛选培养基在1号培养基抑菌效果的基础上降低了羧苄青霉素的浓度，为250 mg/L。减轻羧苄青霉素对愈伤组织生长的抑制作用；卡那霉素的浓度增加到100 mg/L，增加了对非转化细胞的筛选压力。少量非转化细胞在较高的卡那霉素浓度下生长受到抑制，表现为细胞叶绿素减少，叶片愈伤细胞黄化，达到了筛选目的。

由图3可知，2号培养基筛选后的转化细胞不受卡那霉素浓度增加的影响，经过一段时间的培养出现生长正常的绿色分化芽，同时还有少量已经分化的芽在后期表现出黄化现象，是非转化细胞分化后受培养基中高浓度卡那霉素的持续抑制产生的结果。可根据分化芽的黄化数量计算转化率。

2.2 不同预培养时间对番茄外植体转化率的影响

从表1可以看出，预培养8 h的番茄外植体转化率与对照相比有所增加，但增加幅度不大。预培养32～48 h番茄外植体转化率与对照相比明显增加，其转化率均大于70%，差异均达极显著水平；当预培养时间超过48 h后，转化率大幅度下降，预培养时间达到56 h时转化率为0，说明此时番茄叶芽伤口可能已经愈合，这时菌液浸泡叶芽，工程菌细胞质粒中的T-DNA已不能向番茄细胞中转移。

3 小结

本试验结果表明，农杆菌介导的外源基因转化过程中，不经预培养的番茄外植体经叶盘法转化，转化率相对较高，达到41.67%。在不同预培养时间内，最适宜的预培养时间为32～48 h，番茄外植体转化率大幅度提高。番茄外植体经32～48 h的预培养后再进行常规的转基因操作，此时工程菌细胞对叶芽边缘的细胞伤口多数形成初愈伤，细胞完整吸附效果好，能明显提高T-DNA区携带的外源目的基因向植物基因组转化的成功率。

参考文献：

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[5] 赵 爽，雷建军，陈国菊，等.番茄抗病毒基因工程研究进展[J]. 生命科学研究，2007，41（11）：83-86.

[6] 律凤霞，潘永明，郭兆奎.外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达[J].西北植物学报，2009，29（10）：1962-1966.

[7] 律凤霞，郭兆奎，颜培强，等.TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建[J].植物研究，2008，28（3）：310-314.

[8] 潘永明.根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化[J].北方园艺，2010（18）：142-144.

[9] WANG Y H， MOSEBACH C M， KIBBEY A S， et al. Generation of Arabidopsis mutants by heterologous expression of a full-Length cDNA library from tomato[J].Plant Mol Biol Rep，2009，27（4）： 454-461.

[10] EOM H， LEE C G， JIN E. Gene expression profile analysis in astaxanthin-induced Haematococcus pluvialis using a cDNA microarray[J].Planta，2006，223（6）：1231-1242.

[11] LI W Z， CHINNAPPA C C. Isolation and characterization of PHYC gene from Stellaria longipes： Differential expression regulated by different red/far-red light ratios and photoperiods[J].Planta，2004，220（2）： 318-330.endprint