鱼类性别决定及分化相关基因研究进展

路畅+苏利娜+朱邦科

摘要：综述了Sox、DMRT、芳香化酶、FTZ-F1、FOXL2、Pod1、GSDF、Fanconi anemia/BRCA等一些与鱼类性别决定及分化相关的基因的研究动态与进展。旨在为系统研究鱼类性别决定机制提供参考。

关键词：鱼类；性别决定基因；Sox；DMRT；芳香化酶基因；FOXL2

中图分类号：S965；Q132.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-2981-05

Advances on the Genes Related with Sex Determination and Differentiation of Fish

LU Chang1， 2，SU Li-na1，ZHU Bang-ke2

（1.College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；

2. Faculty of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China）

Abstract： The trends and progresses of studying some sex determination and differentiation related genes of fish including Sox，DMRT， aromatase，FTZ-F1，FOXL2， Pod1，GSDF and Fanconi anemia/BRCA were reviewed to provide a reference for understanding mechanism of sex determination in fish.

Key words： fish； sex determination gene； Sox； DMRT； aromatase gene； FOXL2

鱼类是脊椎动物中最低等但却是分布最广、种类最多的一类生物。鱼类在进化上比较原始，与高等脊椎动物相比，其性别决定的遗传力较小。鱼类的性别发育以遗传因素为基础，并受到外界环境和自身内分泌调节的影响，是三者相互作用的结果，因此鱼类的性别决定机制复杂多变，而且没有一个普遍的模式。鱼类中存在从雌雄同体到雌雄异体，从遗传决定型到环境决定型的各种性别决定类型，性逆转在鱼类中也是较为常见的现象，基本上具有所有脊椎动物的性别决定方式，因此鱼类是一个极好的研究性别决定机制进化的模型。

了解鱼类性别决定特点对于研究者寻找鱼类性别决定相关基因及性染色体有很大的帮助。鱼类的性染色体组成形式多样，且其性染色体的出现与否及性染色体的种类与它们的系统进化地位无关，在亲缘关系较近的种类中，可能会具有完全不同的性染色体类型，如尼罗非鱼（Tilapianilotica）为XX/XY型，而奥利亚罗非鱼（Tilapia aureus）为ZW/ZZ型[1]。据统计资料显示，在所研究的鱼类中，仅有10%左右的鱼类具有异型性染色体，只在个别鱼类中，如青鳉（Oryzias latipes）[2]已鉴定出性别决定候选基因DMY，可以认为其性别是由性别决定基因控制的。但大多数鱼的性别决定基因还有待探寻和证实。

鱼类性别决定的研究主要集中在与性别相关的基因上，如Sox9基因、DMRT1基因、芳香化酶基因、FTZ-F1基因等，近20年来有关鱼类性别决定与分化机理及性别相关基因的研究已取得了很大的进展。本文将对近年来在鱼类性别相关基因方面所做的研究进行较为系统的综述。

1 与鱼类性别决定相关的基因

1.1 SRY、ZFY、HOX

SRY（Sex-determining region of the Y）是1990年Sinclair等[3]在人类Y染色体上克隆到的一个单拷贝基因，被认为是雄性哺乳动物性别决定的最佳候选基因。目前，已在黄鳝（Monopterus albus）[4]、斑马鱼（Danio rerio）[5]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[6]等鱼中发现了SRY的同源片段，但该同源片段在雌雄个体中都存在且无差异。

ZFY基因（Zine finger Y gene，ZFY）位于Y染色体上，是一个较强的转录激活因子，与精子的形成与发生相关。戢福云等[7]在黄鳝基因组中检测出1条能与ZFY探针杂交的512 bp DNA片段，并将该片段定位到黄鳝的1号染色体上，在珊瑚鱼（Anthias squamipinnis）[8]和斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[9]中也找到了能与ZFY探针发生特异杂交的片段，但在雌雄个体中无差异。

HOX（Homeobox genes）是一组参与动物早期胚胎发育十分关键的基因。付元帅等[10]在对4种鱼央属鱼的研究中发现，这4种鱼的HOX基因同源序列均无性别特异性，也无种间和亚种间特异性。

SRY、ZFY和HOX是与哺乳类、鸟类及某些爬行类性别决定相关的基因，在鱼类中发现了它们的同源片段，但与鱼类性别决定的相关性不大。在性染色体及性别决定机制上，鱼类与其他脊椎动物有很大的不同，这可能与其进化速度及生长环境条件的不同有关。

1.2 Sox基因家族

由于SRY产物具有高度保守的HMG（High mobility group box）序列，被统称为Sox（SRY-Related HMG Box）基因家族，其编码的蛋白质可以与特定的DNA序列结合，是一类重要的转录调控因子。迄今为止，在包括鱼类在内的脊椎动物中至少发现了40种Sox基因，但与鱼类性别决定相关的主要有Sox9、Sox8、Sox3等。

Sox9是紧靠SRY基因的下游基因，被认为是哺乳动物SRY仅有的直接调节的目标基因，在SRY基因表达后被激活，且出现雄性率特异性升高的现象。Sox9基因在硬骨鱼类中也有类似的作用，可促进精巢发育，其表达主要在精子细胞附近。在几种鱼类生殖腺分化的早期，已报道了关于Sox9基因的不完全性别二态性类型和在雌性个体中存在Sox9基因的表达，这些说明了Sox9在性别决定和性别分化的早期不起主要作用，但它可能参与生精小管后期的发育。Dong等[11]发现半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）Sox9a基因在雄性的脑、垂体和性腺中的表达都显著高于雌性，而且Sox9a在9月龄的半滑舌鳎精巢中的表达量达到高峰，并且在原肠胚期的表达量高于其他时期，这说明Sox9a基因对半滑舌鳎的脑-垂体-性腺轴及精原细胞的形成起重要的作用。在鲤（Cyprinus carpio）[12]、奥利亚罗非鱼[13]等硬骨鱼类中克隆并鉴定出了Sox9基因，但其是否与鱼类性别相关有待验证。Sox8是继Sox9之后发现的，它与Sox9有相似的功能，可以替代Sox9的部分功能，但是与Sox9的功能强度相比弱了些[14]。

XX/XY型性别决定的生物中Sox3基因位于X染色体上。姚波等[15]对斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）Sox3基因时空表达的研究证实了Sox3基因在中枢神经系统的发育、卵巢发生和功能维持上有重要作用。Zhou等[16]在对雌雄同体鱼的研究中发现Sox3在精原细胞中表达，但 Sox3继续表达，精原细胞的Sox3阳性向卵原细胞、卵母细胞发育。相反，如果Sox3停止表达，精原细胞的Sox3阳性则向精子发生发展。因此，Sox3作为一个转录因子，在卵子发生过程中起的作用比精子发生过程还要大。

Sox基因家族中与性别相关的基因在不同种类鱼中起不同的作用，甚至是相反的作用，Sox8、Sox9对鱼类的雄性发育起到重要作用，Sox3则对鱼类的雌性发育更重要。

1.3 DMRT基因家族

DMRT（Double-sex and Mab-3 related transcription factor）是近年新克隆到的一类编码与性别决定相关的转录因子的基因家族，被认为是脊椎动物中最原始的性别决定基因，位于常染色体上，其功能可能与精巢足细胞的发育有关。迄今，已在鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类等脊椎动物中检测到了DMRT基因，非脊椎动物如果蝇和线虫中也发现了DMRT1基因参与性别决定，这充分显示了该基因家族在进化上的高度保守性。作为发育基因，其作用机理是产生具有时空差异的转录调控因子，以锌指方式与特异的DNA序列结合，在性别决定和分化发育中起调控作用。对半滑舌鳎[17]、尼罗罗非鱼（Tilapia nilotica）[18]的研究发现DMRT1基因只在成鱼的精巢中特异性地表达，在其他组织中无表达，这说明了DMRT1基因在雄性发育中起到重要作用。DMRT基因家族的其他成员在性别发育中也起到一定的作用。

DMY（the DM-domain gene on the Y chromosome）基因是在青鳉Y染色体上找到的一段DMRT1的复制片段，雌性个体中没有它的同源序列，这是首次在鱼类基因组中找到的，被证明是与精巢发生和分化直接相关的一个性别决定功能基因[2]。青鳉DMY基因是雄性个体正常发育的重要基因，Matsuda等[19]用一个携带DMY基因的117 kb DNA片段诱导硬骨鱼类的性别分化，随后发现了青鳉雌性（XX）个体向雄性方向发展。对于青鳉而言，雌雄个体的区别只是单个的基因，那么就可以利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别。Kondo等[20]首先以与青鳉同属的西里伯斯青鳉（Oryzias celebensis）为研究对象，以青鳉DMY和DMRT1基因为探针，用DNA印迹法研究在这种鱼类中是否存在DMY基因，结果未能检测出雄性特异性条带。但是Matsuda等[21]通过PCR方法在弓背青鳉（Oryzias curvinotus）中克隆到了DMY基因。由于鱼类在进化上原始而不彻底的特点，在性别决定上出现一定的偏差也是有可能的。

1.4 芳香化酶基因

芳香化酶是属于细胞色素P450的一种复合酶，也是体内由雄激素合成雌激素的重要酶类。在鱼类中，芳香化酶可通过调节体内雄激素和雌激素的比例，进而控制性别分化和发育的方向。硬骨鱼类有脑型（cyp19a1b）和卵巢型（cyp19a1a）两种芳香化酶基因，它们具有不同的表达调控机制，但具有相同的催化活性。芳香化酶的生物合成发生在所有脊椎动物中，但在大多数脊椎动物中只分布在脑和性腺中，在灵长类动物中的分布更广泛，甚至在发育胎儿的胎盘及脂肪组织中也有分布[22]。Jeng等[23]对日本鳗鲡（Anguilla japonica）芳香化酶基因的研究发现，脑中芳香化酶的活性在雌雄个体中没有差别，但在卵巢中能检测到该基因，在精巢中却无法检测到，表明了芳香化酶对卵巢的分化起到重要作用。邓思平[24]在对半滑舌鳎的研究中发现cyp19a1a只在性腺中表达，且在性腺发育过程中，精巢和卵巢中的芳香化酶基因的表达都逐渐增强，但卵巢中的表达量始终高于精巢，进一步用甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性逆转为雄性后，性腺中芳香化酶的表达量降低。这些结果表明cyp19a1a参与了半滑舌鳎的性腺发育和性别决定过程。青鳉芳香化酶基因有9个外显子，其内含子大小明显小于人类，但其剪接位点与人类的相同[25]，这些说明在脊椎动物中芳香化酶结构及其表达调节机制的保守性。现已证明，给予芳香化酶抑制剂能诱导产生雄鱼，这主要是因为阻止了芳香化酶基因的表达，导致雌激素含量减少所引起的。最近的研究发现环境因子对最终性别的影响可以通过调节芳香化酶的活性来实现。通过对芳香化酶作用及基因表达的研究显示，芳香化酶基因是影响性腺分化较直接的因素，且芳香化酶基因与其他性别决定及分化相关基因间有抑制或促进作用，研究该基因表达的调控是鱼类性别决定分子机制的重要部分。

1.5 FTZ-F1基因

FTZ-F1（Ftshi tarazu-factor1）是核受体超家族的一员，最初是在果蝇中发现的，对芳香化酶基因的表达起促进作用。Zhang等[26]用睾酮处理石斑鱼的试验证明了FTZ-F1受脑-垂体-性腺轴控制。Hofsten等[27]综述了斑马鱼的性别相关基因，得出FTZ-F1在其性别决定与分化中起到关键性作用，其表达类型与生殖腺分化及功能相一致。此外，虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[28]、黄鳝[29]、半滑舌鳎[30]等鱼类中FTZ-F1在雌性个体中的表达量均高于雄性。

1.6 FOXL2基因

FOXL2（Winged helix/forkhead transcription factor gene 2）属于转录因子家族，是目前发现的脊椎动物卵巢决定和分化的最早的标志性启动基因，它可以调节卵巢芳香化酶，对卵巢的分化起到重要作用。Sridevi等[31]对革胡子鲶（Clarias gariepinus）的研究发现，FOXL2主要在卵巢和雌性个体的脑中，在产卵前其表达量最大，这说明其对卵巢的再生起到了重要作用。该研究证实了FOXL2对革胡子鲶芳香化酶的调控作用，并把FOXL2选定为一个对鲶雌性性腺发育很有潜力的卵巢和脑的标记。

1.7 Pod 1基因

过氧化物酶1（Peroxidase 1，Pod 1）是转录因子中碱性螺旋-环-螺旋家族的一个成员，已被证实与哺乳动物的性别分化和生殖腺发生相关。小鼠Pod 1基因的敲除，可导致个体发生由雄性到雌性的性逆转[32]。在非哺乳类脊椎动物中的研究较少，Li等[33]从尼罗罗非鱼中克隆并鉴定出Pod 1基因，通过原位杂交技术检测出Pod 1的时空表达，在未分化的生殖腺中，Pod 1在雌雄两性个体的体细胞中都有表达，随后，在分化的稚鱼和成鱼的卵巢和精巢中持续表达，这说明Pod 1不是性别分化所必须的，但在雌雄两性鱼类生殖腺发育过程中起到重要作用。该研究第一次揭示了Pod 1在硬骨鱼类性别分化初期和生殖腺发育中均起到了重要作用。

1.8 GSDF基因

GSDF（Gonadal soma-derived factor）基因是TGF-β超家族中奇异的一员，在硬骨鱼类中很保守。Shibata等[34]从青鳉中克隆出GSDF基因，实时定量PCR技术显示受精后6 d，雄性个体整个胚胎的GSDF基因的表达量升高，这与睾丸分化的起始是一致的。GSDF基因在XY型生殖腺中的表达量明显高于XX型。XY型胚胎用17-β雌二醇处理后再进行实时定量PCR技术检测，发现GSDF在处理后胚胎中的表达量下降。Gautier等[35]对斑马鱼的研究中发现GSDF是由单拷贝基因编码的，其基因主要在成年个体的粒层细胞和支持细胞中表达。对GSDF及其邻近基因的研究发现，GSDF是惟一在精巢中表达量高于卵巢的线性染色体基因，相反，GSDF相邻基因，如nup54、aff1等则优先在雌性的生殖腺中表达。Sawatari等[36]报道GSDF刺激虹鳟的精原细胞的增殖和精子的发生，与其性别分化有一定的关系。

1.9 Fanconi anemia/BRCA基因

Fanconi anemia/BRCA（即范康尼贫血症）是类似于骨髓衰竭、白血病、鳞状细胞癌及包括生殖功能不良、不孕症等发育异常的一种人类疾病。斑马鱼基因组与人类相似度达到87%，对于该基因只在斑马鱼中有研究。据Rodríguez-Marí等[37]的研究，斑马鱼有一个与人的FANC基因同源的基因，两个及两个以上FANG基因的突变[如fund和fancd1（brca2）]可导致其由雌性到雄性的性逆转。Fancl是Fanconi anemia/BRCA DNA修复途径中的一个成员，在减数分裂中对提高卵母细胞的成活率发挥了重要作用。该基因的突变可使卵原细胞高效转化成成熟卵母细胞的过程受阻，而引起斑马鱼由雌性到雄性的性逆转。

2 性别决定与分化相关基因之间的关系

2.1 Sox基因与DMRT基因在性别决定中的相互关系

在哺乳动物如小鼠中，SRY开始表达在DMRT1之后[38]，因此推断，DMRT1位于SRY的上游，DMRT1启动SRY的表达；在非哺乳类脊椎动物如鸡的Sox9基因及爬行类、两栖类、鱼类中的DMRT1基因均在胚胎未分化的性腺中表达，因此推断，在非哺乳类脊椎动物中，Sox9和DMRT1都可能位于性别决定基因的上游。

2.2 FTZ-F1基因与芳香化酶基因之间的关系

在包括人[39]及乌龟[40]在内的一些物种中已经证实了芳香化酶基因的表达量依赖于FTZ-F1的表达水平。在斑马鱼中，Cyp19的启动子区域包含了FTZ-F1基因的结合位点，这说明FTZ-F1在性腺中对芳香化酶的表达起到一定的作用。

Watanabe等[41]对青鳉的研究发现，卵泡中芳香化酶基因的表达在转录水平上进行调节。他们从青鳉卵泡中克隆出编码FTZ-F1样蛋白的cDNA序列，在体外转录成mdFTZ-F1，与从青鳉卵泡中提取的核酸进行杂交，用核酸探针检测出复合物，这说明在青鳉芳香化酶基因启动子区域包含了孤核受体的结合基序。卵子发生时，mdFTZ-F1的转录正好与芳香化酶基因的转录相一致。转染试验进一步说明了mdFTZ-F1在青鳉芳香化酶基因启动子区域潜在的转录调节活性。不同的是Liu等[42]对发生天然性逆转且雄性先熟黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）的两种性别相关基因表达的研究中发现，卵巢中2+龄鱼芳香化酶基因的转录水平明显高于1+龄和5+龄鱼，结果说明芳香化酶基因可能参与了黑鲷天然性逆转，但卵巢中FTZ-F1在不同的年龄组中没有变化，得出FTZ-F1对芳香化酶不起上调作用的结论。