解淀粉芽孢杆菌T1增殖培养基配方及培养条件优化

于靓+程德勇+熊儒先+缪礼鸿

摘要：以解淀粉芽孢杆菌T1为研究菌种，从5种培养基中选出最有利于其生长的基础发酵培养基，并通过单因子试验和正交试验，对基础发酵培养基的配方及发酵条件进行了优化。结果表明，解淀粉芽孢杆菌T1的最优培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最优培养条件为pH 7.0，装瓶量80 mL/250 mL、接种量5%、温度37 ℃、摇床转速180 r/min、 发酵时间36 h。优化后的培养液中解淀粉芽孢杆菌T1活菌数由1.4×109 cfu/mL增加至3.5×109 cfu/mL。

关键词：解淀粉芽孢杆菌；培养基；优化；活菌数

中图分类号： S188 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3621-04

Optimizing the Medium and Culture Conditions for the Multiplication of Bacillus amyloliquefaciens T1 Strain

YU Jing，CHENG De-yong，XIONG Ru-xian，MIAO Li-hong

（Shool of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： Using Bacillus amyloliquefaciens T1 as strain， five well-defined culture media were selected to promote its multiplication. The proportion of each component and the culture condtions were optimized with single factor test and orthogonal test. The results showed that a maximal yield of cell amount could be obtained in the medium containing 1% compound amino acid nutrient solution，1.5% peptone，5% molasses and 2.5% soluble starch. The best cultivation conditions were pH 7.0， bottling volume 80 mL/250 mL， inoculum size of 5%， temperature 37 ℃， shaking speed 180 r/min， culture time 36 h. Compared with the initial conditions， the optimized medium and culture conditions resulted in a remarkable increase of the strain multiplication. The maximum yield of the bacteria cells was improved from 1.4×109 cfu/mL to 3.5×109 cfu/mL.

Key word： Bacillus amyloliquefaciens；medium；optimization；viable count

收稿日期：2014-03-18

基金项目：国家“863”计划项目（2013AA102805-04）

作者简介：于 靓（1985-），女，湖北武汉人，硕士，研究方向为环境微生物，（电话）13476056651（电子信箱）jing_yu21@163.com；通讯作者，缪礼

鸿（1965-），男，安徽巢县人，教授，博士，主要从事环境微生物方面的研究，（电话）13971661012（电子信箱）miaowhpu@126.com。

解淀粉芽孢杆菌是广泛存在于自然界的一种非致病性细菌，该菌与枯草芽孢杆菌亲缘性很高，次生代谢产物产生能力较强，能够分泌抗生素、抗菌蛋白、多肽类物质，从而对多种病原菌、真菌等具有良好的抑制作用[1-4]。如权春善等[5]从堆肥中分离到一株对植物病原菌尖孢镰刀菌具有强抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌Q-12；解淀粉芽孢杆菌FZB42对欧文氏菌引起的梨火疫病具有防治效果[6]。研究表明解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质为抑菌蛋白[7，8]。

解淀粉芽孢杆菌T1由武汉轻工大学资源与环境微生物研究室分离得到。解淀粉芽孢杆菌T1能够产生非蛋白质类溶藻活性物质[9]。这使其具有抑制有害藻，促进有益藻生长的功能。因此解淀粉芽孢杆菌T1菌剂可防治微囊藻水华、修复养殖水体生态，还可安全应用于发酵生产、水产、动物饲料中。据曹海鹏等[10]研究，解淀粉芽孢杆菌对养殖水中氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和pH等理化因子的影响均控制在水产养殖动物的安全浓度范围内。本研究从5种液体发酵培养基中选择出最有利于解淀粉芽孢杆菌T1生长的培养基，并通过单因子试验和正交试验优化培养基，得出最优培养基配方，为其大规模生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：解淀粉芽孢杆菌T1由武汉轻工大学资源与环境微生物研究室分离获得。

复合氨基酸营养液：总氮含量6.2%、NaCl含量20%。

1.2 培养基

试验所用培养基配方如表1所示，培养基pH 均为7.0，121 ℃灭菌20 min备用。

1.3 解淀粉芽孢杆菌T1发酵培养基的选择endprint

将活化好的解淀粉芽孢杆菌T1接种到牛肉膏液体培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h。将制备好的种子液以5%接种量接种到5种液体发酵培养基中，装瓶量为100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min摇床培养，分别在24、36、48、60 h采用稀释平板涂布计数法测定活菌数，即将菌悬液涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，于37 ℃恒温培养24 h后测定菌落数。

1.4 单因素试验

分别测定接种量、培养基pH、培养基装瓶量、碳源、氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响。①接种量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，分别以3%、5%、7%、10%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；②培养基pH。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，分别调节培养基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；③培养基装瓶量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，在250 mL锥形瓶中分别装60、80、100、120 mL液体发酵培养基，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；④碳源。选择蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4种碳源分别加入到氮源液体发酵培养基中，添加量均为5 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；⑤氮源。选择牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、尿素和复合氨基酸营养液5种氮源分别加入到碳源液体发酵培养基中，添加量均为3 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液。

以上各试验接种液在37 ℃、180 r/min摇床培养36 h后，测定发酵培养液中解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，选择2种碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2种氮源（蛋白胨、复合氨基酸营养液）和3个水平，采用L9（34）正交试验确定最佳培养基配方，正交试验因素水平如表2所示。

采用SPSS软件分析试验结果。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌T1发酵培养基的选择结果

将解淀粉芽孢杆菌T1接种到5种液体发酵培养基中，采用稀释涂布平板法分别测定在24、36、48、60 h时解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数，结果如图1所示。由图1可知，解淀粉芽孢杆菌T1在液体发酵培养基3中发酵36 h时活菌数最大，达到1.4×109 cfu/mL。因此，以液体发酵培养基3和发酵36 h作为解淀粉芽孢杆菌T1的基础培养基和发酵时间进行后续试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图2所示。由图2可知，当接种量为5%时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高。因此，选择接种量为5%。

2.2.2 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图3所示。由图3可知，当培养基pH为7.0时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高，因此，最适宜解淀粉芽孢杆菌T1生长的pH为7.0。

2.2.3 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图4所示。由图4可知，培养基装瓶量为80 mL/250 mL时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为2.3×109 cfu/mL，达到最高，所用培养基最优装瓶量为80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图5所示。由图5可知，糖蜜作为发酵培养基碳源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为9.0×108 cfu/mL，故选择糖蜜和可溶性淀粉2种碳源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.2.5 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图6所示。由图6表明，蛋白胨作为发酵培养基氮源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.6×109 cfu/mL，其次是复合氨基酸营养液作为发酵培养基氮源时解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，故选择蛋白胨和复合氨基酸营养液2种氮源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.3 正交试验优化结果

正交试验结果如表3、表4所示。由表3可知，极差R值的大小为C>B>D>A，即对解淀粉芽孢杆菌T1生长的影响由大到小依次为糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和复合氨基酸营养液。通过直观分析和方差分析，得到A1B3C3D3的组合为最优方案。

选择A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的组合进行验证试验，同时用LB液体培养基作为参比培养基，发酵36 h测定解淀粉芽孢杆菌T1活菌数，3次重复。结果表明，解淀粉芽孢杆菌T1在A1B3C3D3组合中的活菌数最高，达到3.5×109 cfu/mL，而在LB液体培养基中的活菌数仅为7.2×108 cfu/mL，其活菌数是LB液体培养基活菌数的4.86倍，是未优化的液体发酵培养基3活菌数（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1组合下，其活菌数分别为2.58×109、2.63×109 cfu/mL。验证试验结果与正交试验结果相符，故解淀粉芽孢杆菌T1的最佳发酵培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小结

从5种液体发酵培养基中选择出培养解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最大的基础发酵培养基，再通过单因素试验和正交试验对培养条件和基础发酵培养基进行优化。结果表明，最优培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最优培养条件为装瓶量80 mL/250 mL、接种量5%、pH 7.0、温度37 ℃、180 r/min、发酵时间36 h。优化后的培养液中解淀粉芽孢杆菌T1活菌数可达3.5×109 cfu/mL，为液体发酵培养基3活菌数1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

参考文献：

[1] 车晓曦，李校堃.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究进展[J].北京农业，2010（3）：7-10.

[2] 林艺芬，林河通，陈艺晖，等.生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J].包装与食品机械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吴为中，吴伟龙，等.解淀粉芽孢杆菌对鱼腥藻的抑制效果分析与机理初探[J].环境科学学报，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陈 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究[J].现代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 权春善，王军华，徐洪涛，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件的初步研究[J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志辉，赵凤梅，等.解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物学通报，2008，35（6）：903-908.

[8] 张宝俊，张家榕，韩巨才，等.内生解淀粉芽孢杆菌LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报，2010，37（2）：143-147.

[9] 许 波，于 靓，缪礼鸿，等.一株芽孢杆菌溶藻活性物质的特性研究[J].武汉工业学院学报，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鹏，卫若鹏，何 珊，等.水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价[J].中国生物工程杂志，2012，32（5）：58-65.endprint

将活化好的解淀粉芽孢杆菌T1接种到牛肉膏液体培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h。将制备好的种子液以5%接种量接种到5种液体发酵培养基中，装瓶量为100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min摇床培养，分别在24、36、48、60 h采用稀释平板涂布计数法测定活菌数，即将菌悬液涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，于37 ℃恒温培养24 h后测定菌落数。

1.4 单因素试验

分别测定接种量、培养基pH、培养基装瓶量、碳源、氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响。①接种量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，分别以3%、5%、7%、10%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；②培养基pH。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，分别调节培养基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；③培养基装瓶量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，在250 mL锥形瓶中分别装60、80、100、120 mL液体发酵培养基，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；④碳源。选择蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4种碳源分别加入到氮源液体发酵培养基中，添加量均为5 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；⑤氮源。选择牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、尿素和复合氨基酸营养液5种氮源分别加入到碳源液体发酵培养基中，添加量均为3 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液。

以上各试验接种液在37 ℃、180 r/min摇床培养36 h后，测定发酵培养液中解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，选择2种碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2种氮源（蛋白胨、复合氨基酸营养液）和3个水平，采用L9（34）正交试验确定最佳培养基配方，正交试验因素水平如表2所示。

采用SPSS软件分析试验结果。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌T1发酵培养基的选择结果

将解淀粉芽孢杆菌T1接种到5种液体发酵培养基中，采用稀释涂布平板法分别测定在24、36、48、60 h时解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数，结果如图1所示。由图1可知，解淀粉芽孢杆菌T1在液体发酵培养基3中发酵36 h时活菌数最大，达到1.4×109 cfu/mL。因此，以液体发酵培养基3和发酵36 h作为解淀粉芽孢杆菌T1的基础培养基和发酵时间进行后续试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图2所示。由图2可知，当接种量为5%时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高。因此，选择接种量为5%。

2.2.2 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图3所示。由图3可知，当培养基pH为7.0时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高，因此，最适宜解淀粉芽孢杆菌T1生长的pH为7.0。

2.2.3 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图4所示。由图4可知，培养基装瓶量为80 mL/250 mL时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为2.3×109 cfu/mL，达到最高，所用培养基最优装瓶量为80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图5所示。由图5可知，糖蜜作为发酵培养基碳源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为9.0×108 cfu/mL，故选择糖蜜和可溶性淀粉2种碳源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.2.5 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图6所示。由图6表明，蛋白胨作为发酵培养基氮源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.6×109 cfu/mL，其次是复合氨基酸营养液作为发酵培养基氮源时解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，故选择蛋白胨和复合氨基酸营养液2种氮源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.3 正交试验优化结果

正交试验结果如表3、表4所示。由表3可知，极差R值的大小为C>B>D>A，即对解淀粉芽孢杆菌T1生长的影响由大到小依次为糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和复合氨基酸营养液。通过直观分析和方差分析，得到A1B3C3D3的组合为最优方案。

选择A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的组合进行验证试验，同时用LB液体培养基作为参比培养基，发酵36 h测定解淀粉芽孢杆菌T1活菌数，3次重复。结果表明，解淀粉芽孢杆菌T1在A1B3C3D3组合中的活菌数最高，达到3.5×109 cfu/mL，而在LB液体培养基中的活菌数仅为7.2×108 cfu/mL，其活菌数是LB液体培养基活菌数的4.86倍，是未优化的液体发酵培养基3活菌数（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1组合下，其活菌数分别为2.58×109、2.63×109 cfu/mL。验证试验结果与正交试验结果相符，故解淀粉芽孢杆菌T1的最佳发酵培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小结

从5种液体发酵培养基中选择出培养解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最大的基础发酵培养基，再通过单因素试验和正交试验对培养条件和基础发酵培养基进行优化。结果表明，最优培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最优培养条件为装瓶量80 mL/250 mL、接种量5%、pH 7.0、温度37 ℃、180 r/min、发酵时间36 h。优化后的培养液中解淀粉芽孢杆菌T1活菌数可达3.5×109 cfu/mL，为液体发酵培养基3活菌数1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

参考文献：

[1] 车晓曦，李校堃.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究进展[J].北京农业，2010（3）：7-10.

[2] 林艺芬，林河通，陈艺晖，等.生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J].包装与食品机械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吴为中，吴伟龙，等.解淀粉芽孢杆菌对鱼腥藻的抑制效果分析与机理初探[J].环境科学学报，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陈 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究[J].现代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 权春善，王军华，徐洪涛，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件的初步研究[J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志辉，赵凤梅，等.解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物学通报，2008，35（6）：903-908.

[8] 张宝俊，张家榕，韩巨才，等.内生解淀粉芽孢杆菌LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报，2010，37（2）：143-147.

[9] 许 波，于 靓，缪礼鸿，等.一株芽孢杆菌溶藻活性物质的特性研究[J].武汉工业学院学报，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鹏，卫若鹏，何 珊，等.水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价[J].中国生物工程杂志，2012，32（5）：58-65.endprint

将活化好的解淀粉芽孢杆菌T1接种到牛肉膏液体培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h。将制备好的种子液以5%接种量接种到5种液体发酵培养基中，装瓶量为100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min摇床培养，分别在24、36、48、60 h采用稀释平板涂布计数法测定活菌数，即将菌悬液涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，于37 ℃恒温培养24 h后测定菌落数。

1.4 单因素试验

分别测定接种量、培养基pH、培养基装瓶量、碳源、氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响。①接种量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，分别以3%、5%、7%、10%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；②培养基pH。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，分别调节培养基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；③培养基装瓶量。以液体发酵培养基3作为基础发酵培养基，pH调至7.0，在250 mL锥形瓶中分别装60、80、100、120 mL液体发酵培养基，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；④碳源。选择蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4种碳源分别加入到氮源液体发酵培养基中，添加量均为5 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液；⑤氮源。选择牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、尿素和复合氨基酸营养液5种氮源分别加入到碳源液体发酵培养基中，添加量均为3 g，以5%接种量接种解淀粉芽孢杆菌T1种子液。

以上各试验接种液在37 ℃、180 r/min摇床培养36 h后，测定发酵培养液中解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，选择2种碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2种氮源（蛋白胨、复合氨基酸营养液）和3个水平，采用L9（34）正交试验确定最佳培养基配方，正交试验因素水平如表2所示。

采用SPSS软件分析试验结果。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌T1发酵培养基的选择结果

将解淀粉芽孢杆菌T1接种到5种液体发酵培养基中，采用稀释涂布平板法分别测定在24、36、48、60 h时解淀粉芽孢杆菌T1的活菌数，结果如图1所示。由图1可知，解淀粉芽孢杆菌T1在液体发酵培养基3中发酵36 h时活菌数最大，达到1.4×109 cfu/mL。因此，以液体发酵培养基3和发酵36 h作为解淀粉芽孢杆菌T1的基础培养基和发酵时间进行后续试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响接种量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图2所示。由图2可知，当接种量为5%时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高。因此，选择接种量为5%。

2.2.2 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基pH对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图3所示。由图3可知，当培养基pH为7.0时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，达到最高，因此，最适宜解淀粉芽孢杆菌T1生长的pH为7.0。

2.2.3 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 培养基装瓶量对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图4所示。由图4可知，培养基装瓶量为80 mL/250 mL时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为2.3×109 cfu/mL，达到最高，所用培养基最优装瓶量为80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同碳源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图5所示。由图5可知，糖蜜作为发酵培养基碳源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为9.0×108 cfu/mL，故选择糖蜜和可溶性淀粉2种碳源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.2.5 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌T1活菌数的影响如图6所示。由图6表明，蛋白胨作为发酵培养基氮源时，解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最高，为1.6×109 cfu/mL，其次是复合氨基酸营养液作为发酵培养基氮源时解淀粉芽孢杆菌T1活菌数为1.4×109 cfu/mL，故选择蛋白胨和复合氨基酸营养液2种氮源因素进行正交试验优化发酵培养基筛选。

2.3 正交试验优化结果

正交试验结果如表3、表4所示。由表3可知，极差R值的大小为C>B>D>A，即对解淀粉芽孢杆菌T1生长的影响由大到小依次为糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和复合氨基酸营养液。通过直观分析和方差分析，得到A1B3C3D3的组合为最优方案。

选择A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的组合进行验证试验，同时用LB液体培养基作为参比培养基，发酵36 h测定解淀粉芽孢杆菌T1活菌数，3次重复。结果表明，解淀粉芽孢杆菌T1在A1B3C3D3组合中的活菌数最高，达到3.5×109 cfu/mL，而在LB液体培养基中的活菌数仅为7.2×108 cfu/mL，其活菌数是LB液体培养基活菌数的4.86倍，是未优化的液体发酵培养基3活菌数（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1组合下，其活菌数分别为2.58×109、2.63×109 cfu/mL。验证试验结果与正交试验结果相符，故解淀粉芽孢杆菌T1的最佳发酵培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小结

从5种液体发酵培养基中选择出培养解淀粉芽孢杆菌T1活菌数最大的基础发酵培养基，再通过单因素试验和正交试验对培养条件和基础发酵培养基进行优化。结果表明，最优培养基配方为复合氨基酸营养液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最优培养条件为装瓶量80 mL/250 mL、接种量5%、pH 7.0、温度37 ℃、180 r/min、发酵时间36 h。优化后的培养液中解淀粉芽孢杆菌T1活菌数可达3.5×109 cfu/mL，为液体发酵培养基3活菌数1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

参考文献：

[1] 车晓曦，李校堃.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究进展[J].北京农业，2010（3）：7-10.

[2] 林艺芬，林河通，陈艺晖，等.生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J].包装与食品机械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吴为中，吴伟龙，等.解淀粉芽孢杆菌对鱼腥藻的抑制效果分析与机理初探[J].环境科学学报，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陈 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究[J].现代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 权春善，王军华，徐洪涛，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件的初步研究[J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志辉，赵凤梅，等.解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物学通报，2008，35（6）：903-908.

[8] 张宝俊，张家榕，韩巨才，等.内生解淀粉芽孢杆菌LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报，2010，37（2）：143-147.

[9] 许 波，于 靓，缪礼鸿，等.一株芽孢杆菌溶藻活性物质的特性研究[J].武汉工业学院学报，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鹏，卫若鹏，何 珊，等.水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价[J].中国生物工程杂志，2012，32（5）：58-65.endprint