响应面法对烟草中非挥发性有机酸含量测定的优化

邱宝平+王政+刘晓旭+郭连民+祁林+郭鹏+陈亮+张峻松

摘要：采用响应面法（RSM）对甲酯化试验条件进行优化， 研究甲酯化条件对烟草中非挥发性有机酸含量测定的影响。根据Box-Behnken Design设计原理，以非挥发性有机酸测定量为指标，考察了H2SO4-CH3OH溶液体积分数、反应温度、反应时间和料液比等条件对非挥发性有机酸测定量的影响。结果表明，烟草中非挥发性有机酸的最优试验条件为：H2SO4-CH3OH溶液体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。在最优的条件下进行了5次验证试验，得到的非挥发性有机酸总量平均值为182.32 mg/g，相对标准偏差为0.92%。

关键词： 烟草；非挥发性有机酸；响应面法；测定

中图分类号：O657.7+1；S572 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3629-05

Optimizing the Determination of Non-volatile Organic Acids in Tobacco with

Response Surface Methodology

QIU Bao-ping1，WANG Zheng2，LIU Xiao-xu1，GUO Lian-min1，QI Lin2，GUO Peng1，CHEN Liang1，ZHANG Jun-song2

（1.Hongta Liaoning Tobacco Co.， Ltd.，Shenyang 110002，China；2.Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： To study effects of the determination on non-volatile organic acids in tobacco， response surface methodology（RSM） was used to optimize of the conditions of methylated. Box-Behnken Design was used to design the experiments. The value of non-volatile organic acids was used as a response value. The concentration of H2SO4-CH3OH solution， reaction temperature and time， ratio of liquid to solid were selected as causal factors. The results showed that the best conditions were H2SO4-CH3OH of 12.0%， the temperature of water bath of 92.0 ℃， the time of reflow of 3.0 h， the solid to liquid ratio of 1∶43. Five validation experiments were carried out under these optimal conditions， the average value of total content of non-volatile organic acid was 182.32 mg/g. The relative standard deviation was 0.92%.

Key words： tobacco； non-volatile organic acid； response surface methodology； determination

收稿日期：2013-09-06

作者简介：邱宝平（1973—），男，辽宁铁岭人，工程师，主要从事卷烟产品配方与质量控制研究；通讯作者，张峻松，教授，硕士生导师，

主要从事烟草方面教学与科研工作，（电话）0371-63670231（电子信箱）13283712413@163.com。

烟草中非挥发性有机酸主要包括多元酸和高级脂肪酸，占烟叶重量的10%左右，可调节烟叶自身的酸碱度，影响烟叶的劲头和吃味，起到平衡烟气的作用，也能影响烟气的香气[1，2]。国内已有关于酯化试验单因素对烟草中非挥发性有机酸测定结果影响的相关报道[3-5]，但未见采用响应面法优化设计烟草非挥发性有机酸的测定条件。响应面法（RSM）根据Box-Behnken Design（BBD）设计的试验结果进行二次多元回归拟合，分析因素与响应值的关系，达到优化试验条件的目的[6-8]，该方法已广泛应用于化学、生物、食品等领域。本研究以烟草中非挥发性有机酸总量为指标，采用响应面法优化烟草非挥发性有机酸的测定条件，以期为卷烟工业的加工利用提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

烟叶由红塔辽宁烟草有限责任公司提供。

硫酸（优级纯，天津市四友精细化学品有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；己二酸二甲酯、草酸二甲酯、丙二酸二甲酯、丁二酸二甲酯、正十三碳酸甲酯、苹果酸二甲酯、硬脂酸甲酯、正十五碳酸甲酯、月桂酸甲酯、柠檬酸甲酯 （分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；棕榈酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯（百灵威科技有限公司）；二氯甲烷、无水硫酸钠、氯化钠（分析纯，天津德恩化学试剂有限公司）。

EL204型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；7820A型气相色谱仪（美国安捷伦公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市科学仪器有限公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 烟叶样品的制备 按照我国烟草行业标准[9]制备烟叶样品及测定其含水率。将烟叶用粉碎机粉碎，过40目筛后置于棕色广口瓶中保存，用烘箱法测定含水率。

1.2.2 H2SO4-CH3OH溶液 在冰水浴搅拌的条件下，将适量浓硫酸缓慢加入一定量的无水甲醇中，搅拌均匀配置成不同体积分数的H2SO4-CH3OH溶液。

1.2.3 内标溶液 称量1.493 1 g己二酸二甲酯于250 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，即得到浓度为5.972 mg/mL的内标溶液（0 ℃冰箱内可保存1个月）。

1.2.4 烟叶样品的甲酯化 准确称取1.000 0 g样品，置于100 mL平底烧瓶中，加入一定体积的硫酸-甲醇溶液，再加入1 mL己二酸内标溶，水浴加热，取回流液10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL饱和氯化钠溶液，每次用10 mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，加入3.0 g无水硫酸钠干燥过夜。采用气相色谱法进行测定。

1.3 气相色谱分析条件

气相色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气；柱流速1.2 mL/min （恒流模式）；平均线速度29.134 cm/sec；进样口温度280 ℃；分流比为5∶1；程序升温，色谱柱初始温度50 ℃（保持2 min），以4 ℃/min升温至220 ℃（保持20 min）；进样量为1.0 μL 。

检测器为FID；检测器温度为280 ℃；氢气为40 mL/min；空气为450 mL/min；尾吹气为20 mL/min。

1.4 非挥发性有机酸定性、定量方法

与标准样品相对保留时间比较，对各非挥发性有机酸定性，采用内标法定量。

2 结果与分析

2.1 工作曲线

称取适量非挥发性有机酸甲酯标准样品于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制7个梯度的标准溶液进行气相色谱分析，并对各标准样品与内标的峰面积之比与相应标样的质量进行回归分析。得到各非挥发性有机酸甲酯线性方程及相关系数，各成分的相关系数为0.997～0.999，表明工作曲线线性关系良好，适用于非挥发性有机酸的定量分析。

2.2 甲酯化反应的单因素试验

2.2.1 不同体积分数的H2SO4-CH3OH溶液对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别使用2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%的H2SO4-CH3OH溶液进行考察，结果如图1所示。

由图1可知，随着H2SO4-CH3OH溶液体积分数的增加，非挥发性有机酸总量也增加，当浓度达到10%时非挥发性有机酸总量最大，之后有所下降。主要原因是在高浓度硫酸环境中，非挥发性有机酸会发生脱水和氧化反应，导致测定结果偏低。

2.2.2 料液比对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别使用25、30、35、40、45、50和55 mL 12%的H2SO4-CH3OH溶液进行试验，结果如图2所示。

由图2可知，随着H2SO4-CH3OH溶液体积的增加，非挥发性有机酸总量测定值也随之增加，当料液比达到1∶45时，非挥发性有机酸总量的测定值最大，所以较合适的料液比为1∶45。

2.2.3 水浴温度对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别取水浴温度60、70、80、90、100 ℃进行试验，结果如图3所示。

由图3可知，随着水浴温度的升高，非挥发性有机酸的测定值也增加，当温度达到90 ℃时测定值接近达到最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。主要原因是随着温度的增加加快了酯化反应，但是温度过高会导致衍生物挥发和分解，导致测定结果偏低， 选取最佳水溶液温度为92 ℃。

2.2.4 回流时间对测定结果的影响 保持其他因素不变，分别选取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h进行试验，结果如图4所示。

由图4所知，随着回流时间的增加，非挥发性有机酸的测定值也增加，当达到3 h时测定值达到最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。主要原因是因为反应时间过长高级脂肪酸会破坏，导致测定值偏低。

2.2.5 CH2Cl2萃取次数对测定结果的影响 保持其他因素不变，对回流液用CH2Cl2萃取1、2、3、4、5、6次，结果如图5所示。

由图5可知，随着萃取次数的增加，非挥发性有机酸的测定值也增加，甲酯化衍生物得到充分萃取，当萃取5次时测定值最大，之后非挥发性有机酸的总量有所下降。因此以下试验使用CH2Cl2萃取5次。

2.3 响应面分析法优化工艺条件

2.3.1 响应面分析方案与试验结果 根据单因素试验的结果，以A-H2SO4-CH3OH溶液的体积分数、B-料液比、C-水浴温度、D-回流时间为考察因素，采用Design-Expert软件为辅助手段设计响应面试验，响应面各因素及水平如表1所示，采用Box-Behnken 设计进行了29组试验。

2.3.2 方差分析和二元回归方程拟合 采用Design-Expert软件对29组试验结果进行二次多元回归拟合，得到非挥发性有机酸的测定值的编码自变量A、B、C、D的二次多项式回归方程：R=196.87+2.81A+2.18B+2.83C+3.21D+0.21AB-0.44AC-0.23AD+0.17BC+0.45BD-4.85CD-1.30A2-8.46B2-5.04C2-2.51D2

对上述回归模型进行方差分析，结果见表2。

由表2可知，模型F值为4.33，概率P<0.05，表示该模型是显著的，非挥发性有机酸测定值与所选因素之间存在显著相关性，回归模型的决定系数（R2=0.812 3）即由这4个因素及其二次项决定， 而失拟项F值为0.77，概率P>0.05，失拟项不显著，说明未知因素对试验结果干扰很小，表示回归方程在整个回归区域的拟合情况良好。4个因素对响应值影响大小顺序为：回流时间>水浴温度>H2SO4-CH3OH溶液体积分数>料液比。回归模型中A2、B2、C2对非挥发性有机酸的测定值影响是显著的（P<0.05）。endprint

2.3.3 交互作用分析 对影响因素的响应面图和等高线图进行分析，更直观的表现两个因素同时对非挥发性有机酸测定值的影响。如图6至图8。

由图6、图8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的浓度和料液比）、BD（料液比和回流时间）、CD（水浴温度和回流时间）的等高线图成椭圆形，表明交互作用对响应值有影响[10]。由图6、图7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的体积分数和料液比）、BD（料液比和回流时间）的交互作用不明显。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

2.3.4 最佳条件的验证试验 为了进一步验证模型的可靠性，对最优条件进行5次试验，非挥发性有机酸测定值平均值为182.32 mg/g，试验方法的相对标准偏差为0.92%。因此，利用响应面分析法得到非挥发性有机酸的最佳测定工艺条件是真实可靠的。

3 结论

利用响应面回归分析法，对测定非挥发性有机酸的试验条件进行优化。以非挥发性有机酸的测定值为指标，对二次多远回归模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的体积分数、料液比、水浴温度、回流时间等试验条件对非挥发性有机酸总量测定值的影响。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

参考文献：

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[9] YC/T 31-1996 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定烘箱法[S].

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[11] 王 涛， 贺 帆， 田斌强， 等. 烤烟烟叶淀粉的提取工艺优化[J]. 烟草科技， 2012 （6）： 80-83.endprint

2.3.3 交互作用分析 对影响因素的响应面图和等高线图进行分析，更直观的表现两个因素同时对非挥发性有机酸测定值的影响。如图6至图8。

由图6、图8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的浓度和料液比）、BD（料液比和回流时间）、CD（水浴温度和回流时间）的等高线图成椭圆形，表明交互作用对响应值有影响[10]。由图6、图7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的体积分数和料液比）、BD（料液比和回流时间）的交互作用不明显。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

2.3.4 最佳条件的验证试验 为了进一步验证模型的可靠性，对最优条件进行5次试验，非挥发性有机酸测定值平均值为182.32 mg/g，试验方法的相对标准偏差为0.92%。因此，利用响应面分析法得到非挥发性有机酸的最佳测定工艺条件是真实可靠的。

3 结论

利用响应面回归分析法，对测定非挥发性有机酸的试验条件进行优化。以非挥发性有机酸的测定值为指标，对二次多远回归模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的体积分数、料液比、水浴温度、回流时间等试验条件对非挥发性有机酸总量测定值的影响。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

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2.3.3 交互作用分析 对影响因素的响应面图和等高线图进行分析，更直观的表现两个因素同时对非挥发性有机酸测定值的影响。如图6至图8。

由图6、图8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的浓度和料液比）、BD（料液比和回流时间）、CD（水浴温度和回流时间）的等高线图成椭圆形，表明交互作用对响应值有影响[10]。由图6、图7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的体积分数和料液比）、BD（料液比和回流时间）的交互作用不明显。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

2.3.4 最佳条件的验证试验 为了进一步验证模型的可靠性，对最优条件进行5次试验，非挥发性有机酸测定值平均值为182.32 mg/g，试验方法的相对标准偏差为0.92%。因此，利用响应面分析法得到非挥发性有机酸的最佳测定工艺条件是真实可靠的。

3 结论

利用响应面回归分析法，对测定非挥发性有机酸的试验条件进行优化。以非挥发性有机酸的测定值为指标，对二次多远回归模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的体积分数、料液比、水浴温度、回流时间等试验条件对非挥发性有机酸总量测定值的影响。

对模型响应面规范分析，结合试验的可操作性，得到非挥发性有机酸测定的最优条件：H2SO4-CH3OH溶液的体积分数为12.0%、水浴温度为92 ℃、回流时间为3.0 h、料液比为1∶43。

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[11] 王 涛， 贺 帆， 田斌强， 等. 烤烟烟叶淀粉的提取工艺优化[J]. 烟草科技， 2012 （6）： 80-83.endprint