一种抗真菌抗生素发酵工艺优化及稳定性研究

朱海东+谢萍华+黄通新+

摘要：镜检观察菌株菌落及细胞形态，用正交试验设计法确定菌株最佳发酵条件。结果表明，该菌株与链霉菌形态类似，革兰氏染色呈阳性，最佳发酵条件为葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，装液量３０ ｍL／２５０ ｍL，发酵时间７２ ｈ。所产抗生素对高温（９５ ℃）具有较高的稳定性，在酸性和中性环境中比较稳定。

关键词：菌株；抗真菌抗生素；发酵工艺

中图分类号：ＴＱ４６５．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2050-02

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ

Ａ Ｋｉｎｄ ｏｆ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ZHU Hai-dong，XIE Ping-hua，HUANG Tong-xin

(Hangzhou Vocational and Technical College，Hangzhou 310018，China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The colony and cell morphology of one strain was observed with microscopy. The orthogonal experiment was conducted to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that this strain was similar to Streptomyces on morphology. G+and the optimal fermentation conditions were glucose 15 g/L，yeast powder 40 g/L, loaded liquid 30 ml/250ml， fermentation time 72 h. The antibiotics produced by the actinomyces strain were highly stable in hot temperature（95 ℃）， acidic or neutral environment.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： bacterial straim； antifungal antibiotic； fermentation process

现代医学的进步提高了重症病人的生存几率，然而由于这些病人的抵抗力较差，易发生条件致病真菌引起的深部感染［１－４］。本研究从土壤中筛选到一株放线菌Actinormyces Ｓ１，前期试验证明该菌株的代谢产物能对部分导致深部真菌感染的微生物具有较好的抑制作用。本研究通过试验了解该菌株的基本生长特点，运用正交试验优化其发酵工艺条件，并对该抗生素粗提物的相关性质进行了研究，为后续对该菌株的进一步深入研究打下基础。

１材料与方法

１．１试验材料

１．１．１试验菌株由杭州职业技术学院生物制药研究所提供。

１．１．２主要培养基斜面培养基：可溶性淀粉２５ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．４ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ １ ｇ、蛋白胨１ ｇ、琼脂２０ ｇ、１０％土豆汁１ Ｌ（小块状土豆１００ ｇ，１ Ｌ水煮沸１ ｈ后过滤定容１ Ｌ，１２１ ℃蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ）；平板培养基（ｇ／Ｌ）：高氏一号培养基［５］；指示菌培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖４０、蛋白胨１０、琼脂２０, ｐＨ ５．６, １１５ ℃蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ；种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１５、硫酸镁０．５、蛋白胨５、磷酸氢二钾１、硫酸亚铁０．０１、碳酸钙０．４, ｐＨ自然，１２１ ℃蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ；原始发酵培养基组成（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０、酵母粉３０、蛋白胨５、磷酸氢二钾１、氯化钠１、碳酸钙１、接种量为１０％，培养基ｐＨ为６．５，装液量５０ ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶。

１．２试验方法

１．２．１菌株生长过程观察将菌株接种至斜面培养基上，恒温３０ ℃培养，当菌株生长至２、３、４、５、６ ｄ时，观察菌落特征，并用印片染色法［６］观察菌株形态，用Ｍｏｔｉｃ数码显微镜观察，拍摄并记录其生长过程。

１．２．２发酵液中抗生素效价测定取１０ ｍL发酵液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液，以白色念珠菌为指示菌株，用生物管碟法［７］测定发酵液抗菌活性。

１．２．３菌株发酵条件优化在原始发酵培养基的基础上，选择对培养基中的碳源葡萄糖、氮源酵母粉以及摇瓶装液量和发酵培养时间４个因素采用Ｌ９（３４）正交试验进行优化［８］，其中４因素分别为葡萄糖的浓度（ｇ／Ｌ）为５、１０、１５，酵母液的浓度（ｇ／Ｌ）２０、３０、４０，摇瓶装液量（ｍL）３０、４０、５０，发酵培养时间（ｈ）６６、７２、７８。

１．２．４抗生素的稳定性研究热稳定性试验。将发酵上清液置于９５ ℃处理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ后，测定其抗生素效价。不同ｐＨ条件下的稳定性试验。将发酵液上清液分为３份，调节ｐＨ，使之分别处于酸、中、碱性环境中，在９５ ℃条件下处理１０ ｍｉｎ后，测定其抗生素效价。

２结果与分析

２．１菌株生长过程观察

３０ ℃恒温培养２ ｄ后，平皿上出现紫色的小型菌落，表面光滑，周围略微可见稀疏菌丝。镜检观察可见少量气生菌丝，颜色较深，菌丝粗而长，分支较多。培养３ ｄ后，菌落紫色渐退，颜色趋灰色，表面干燥丰满，边缘绒状菌丝增多。镜检发现气生菌丝数量明显增多，互相缠绕，部分菌丝前端出现白色透明的孢子丝。培养４ ｄ后，菌落明显增大，颜色为灰色。此时气生菌丝完全交错缠绕成团状，大量菌丝出现白色透明孢子丝，同时可见有少量孢子散落，颜色多呈白色透明。培养５ ｄ后，肉眼可见菌落表面多褶皱突起或颗粒，颜色灰色。镜检观察到大量孢子形成，形成串状或散落成颗粒，具深色。培养６ ｄ后，孢子散开成单个，或２个甚至多个呈链状排列，孢子形状多为椭圆或圆形，颜色深色，菌丝已经完全消失。由此可知该菌株斜面生长至６ ｄ后完全成熟，其菌落和细胞形态上与链霉菌属放线菌相似。革兰氏染色结果显示菌株为阳性菌。

２．２菌株发酵培养优化

根据Ｌ９（３４）正交表对发酵培养基及培养条件进行试验优化，结果及数据处理见表１。由表１可知，当葡萄糖为１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，装液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，发酵培养时间保持在７２ ｈ时，菌株的发酵效价最高。按照该发酵组合进行重复试验３次，发酵液抑菌圈平均直径为２．１８ ｃｍ，优化结果符合预期。

由ｒ值可知，以上４个因素对发酵效价的影响程度由大到小依次为酵母液浓度、装液量、发酵培养时间、葡萄糖浓度，因此在后续的进一步发酵优化时，可重点考虑对结果影响较大的一些因素。

２．３抗生素稳定性分析。

１）热稳定性试验数据显示，当离心分离后的发酵液处于９５ ℃高温处理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ时，所对应的抗生素对指示菌所产生的抑菌圈直径分别为２．１６、２．１３、１．９６、１．８９、１．７６ ｃｍ。以上数据表明，该抗生素在９５ ℃条件下随时间的延长，抑菌效价的下降并不明显，常温下抑菌直径为２．１６ ｃｍ，即使９５ ℃高温处理１２０ ｍｉｎ，抑菌圈直径仍有１．７６ ｃｍ，说明该抗生素对热具有较高的稳定性。试验过程发现，该发酵上清液在高温下出现混浊现象，主要是蛋白质等物质发生了变性并沉淀，预示可以采用高温法去除发酵液中的部分蛋白质等物质。

２）抗生素在酸、中、碱性环境中的稳定性试验数据显示，发酵液处于原液状态时该抗生素对指示菌的抑菌圈直径为２．１４ ｃｍ，当改变发酵液ｐＨ为４、７、９时，抑菌圈直径分别为２．１１、２．１０、０．８０ ｃｍ。以上数据表明，当发酵上清液的ｐＨ为酸性和中性时，虽经高温处理，但该抗生素的抑菌效价变化很微小；而当发酵上清液的ｐＨ为碱性时，该抗生素效价急剧下降，抑菌圈直径由原液的２．１４ ｃｍ下降到０．８０ ｃｍ，说明该抗生素在酸性和中性环境中比较稳定，而在碱性环境中不稳定。试验过程发现，当发酵上清液在酸性条件下高温处理１０ ｍｉｎ后，溶液浊度要大于其他条件；当处于中性条件时，发酵上清液与其他条件相比最清澈， 这个现象可能与发酵液中的蛋白质变性有关，而且这些蛋白质在酸性条件下更易变性。这种现象预示着在对发酵液进行预处理时，可以通过改变其酸度来达到除去部分蛋白质的目的。

３小结与讨论

本试验对筛选获得的一株产抗真菌抗生素的菌株进行了初步研究。菌落和细胞形态的观察发现，该菌株与链霉菌属相似，斜面培养至６ ｄ菌株完全成熟。采用正交试验设计法对该菌株的发酵工艺进行了优化，确定了最佳发酵工艺条件：葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，装液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，发酵时间７２ ｈ。抗生素稳定性试验发现，该抗生素具有较高的耐热性，并在酸性和中性环境下具有相对较高的抑菌活性， 表明该菌具有一定的应用潜力。今后将通过系统分类学方法进一步明确该菌株的种属关系，全面研究该抗生素分离纯化工艺及其理化性质。

参考文献

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［２］ 席丽艳．我国临床新现的条件致病真菌感染［Ｊ］．中国真菌学杂志，２００６，１（５）：２５７－２５９．

［３］ ＧＲＡＮＩＥＲ Ｆ． Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． eｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ，２０００，２９（３７）：２０５１－２０５６．

［４］ 刘自贵，裘雁秋，谭明珍．院内真菌感染及其药物的敏感性分析［Ｊ］．华西医学，２０００，１０（４）：３０４－３０５．

［５］ 沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９．

［６］ 赵斌，何绍江．微生物学实验［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．

［７］ 任董春．浅谈抗生素微生物检定—管碟法操作注意要点［Ｊ］．安徽医药，２００３，７（３）：２３０．

［８］ 正交试验法编写组．正交试验法［Ｍ］．北京：国防工业出版社，１９７６．