草莓花枯病原真菌的PCR检测

王振华+张建坤+徐家文+龚国祥+曾宪东+郑剑++邱国强+

摘要：为了建立简易、快速的草莓花枯病原真菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）的ＰＣＲ检测技术，以从美国ＡＴＣＣ购买的标准菌株１４６９１ＴＭ为试验材料，通过真菌的通用引物对ＩＴＳ４和ＩＴＳ５的ＰＣＲ扩增，从受感染草莓的根、叶、花、果实４个部位分离的菌株扩增到长度为６７０ ｂｐ的特异性条带，ＤＮＡ测序证实了这一扩增产物与ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ内草莓花枯病原真菌的相关序列有高度序列同源性。结合草莓根、叶、花、果实的接种及分离、病原菌形态观察及致病性鉴定等结果，确定通用引物ＰＣＲ扩增技术可以作为草莓花枯病菌检测的基本方法。

关键词：草莓花枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）；植物检疫；ＰＣＲ

中图分类号：Ｓ４１１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2052-03

PCR Detection of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen

WANG Zhen-hua1,ZHANG Jian-kun2,XU Jia-wen1,GONG Guo-xiang1,ZENG Xian-dong1,

ZHENG Jian1,QIU Guo-qiang1

Ａｂｓｔｒａｃｔ： A standard isolate 14691TM from ATTC (U.S.A.) was used to explore an easy and quick PCR detection of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen. PCR amplifications focusing on ITS4 and ITS5 regions by universal fungal primers were done, DNA bands of 670 bp were obtained from root, leaf, blossom and fruit isolates of infected hosts. Results of DNA sequencing showed that the amplified products had high homogeneity with the related sequence in GenBank, NCBI. According to the results of pathogen inoculation and isolation of root, leaf, blossom and fruit, morphological observation and pathogenicity analysis, the universal primer-PCR was a basic method to detect Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ； ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ； ＰＣＲ

草莓花枯病原真菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）是世界范围内广泛分布的一种严重危害草莓产业的病原菌，被列为我国对外公布的检疫性有害生物，目前在国内尚未发现。本研究从美国ＡＴＣＣ购买标准菌株１４６９１ＴＭ，试图开发一种特异引物的ＰＣＲ检测方法，现将试验结果报告如下。

１材料与方法

１．１材料

标准菌株１４６９１ＴＭ［１］（美国ＡＴＣＣ），用于接种、致病性分析的草莓植株品种为晶玉。

１．２特征观察

２０１３年３月将标准菌株１４６９１ＴＭ接种于健康草莓苗，７ ｄ后开始观察草莓的根、叶、花、果实和整个植株的症状。

１．３直接镜检

将有明显病症的根系、花蕾和果实材料置于体视显微镜下检查，直接挑取病部子实体制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录菌丝、担子果、担子的形态特征和着生方式，并测量其大小。

１．４保湿培养

当根系、花蕾或果实上只有可疑病状而无明显病症时，将病根（截成５ ｃｍ）或繁殖材料置于样品袋中，于２０～２５ ℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并进行显微镜检和分离培养。

１．５分离培养

取具有疑似发病症状的根、花冠或叶柄，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用１％ＮａＣｌＯ表面消毒１～２ ｍｉｎ，用无菌水冲洗２次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放入琼脂平板（含２５０ μｇ／ｍＬ的氯霉素）表面，当组织表面长出菌丝后，将菌丝转移至ＰＤＡ平板（含２５０ μｇ／ｍＬ的氯霉素）上，继续培养２～３ ｄ。小心挑取新长出的菌丝，转接到新的ＰＤＡ平板上进行真菌的纯化培养。连续转接２次，获得真菌的纯培养物。

１．６菌丝和核的形态观察

将真菌纯培养物接种在含有１ ｍｍ厚的ＰＤＡ平板上，培养３～５ ｄ，在菌丝生长最旺盛的边缘取出带有菌丝的琼脂碟片，在３．５％的甲醛中固定，用无菌水冲洗，然后在二氨基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ）染色４ ｍｉｎ，再用无菌水退色３ ｍｉｎ。在显微镜紫外光下观察菌丝的形态及核的数量。

１．７ＰＣＲ检测

取菌丝样品１ ｇ，液氮研磨后取样０．１～０．２ｇ，采用ＣＴＡＢ提取法提取样品总ＤＮＡ［２］，应用真菌通用引物对ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）、ＩＴＳ５（５′－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３′）［３］和ｒＤＮＡ－ＩＴＳ片段（核糖体ＩＴＳ１、ＩＴＳ２和５．８Ｓ基因）进行ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ反应总体积为２５ μＬ，含有５０ ｍＭ ＫＣｌ、２０ ｍmol/LＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、２ ｍmol/L ＭｇＣｌ２、２００ μmol/L ｄＮＴＰｓ、０．２ μmol/L同源引物和互补引物、２ Ｕ Ｔａｑ酶和１ μＬ ＤＮＡ模板。

ＰＣＲ反应程序：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９５ ℃变性３０ ｓ， ５０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，共３６个循环；７２ ℃补时延伸５ ｍｉｎ。

扩增产物在１．２％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察扩增结果。６７０ ｂｐ ＤＮＡ片段经纯化后测序，应用ＢＬＡＳＴ与ＧｅｎＢａｎｋ内同源序列进行比对分析。

２结果与分析

２．１感染草莓花枯病原真菌的草莓植株特征

２．１．１根系症状感染病原真菌的草莓根系症状最为明显。整个根系比健康植株的明显小，侧根数量减少，白色肉质根上分布有不规则的黑色块状，根内为黄色到白色。严重感染时，这些黑色区域连成片，使整个白色肉质根变黑。感染的木质根初期外部变为黑色，后来根内也完全变黑，横切木质根时可见根内完全变黑，主根全部或部分（特别是根尖部分）死亡。

２．１．２花症状病原真菌主要侵染花蕾。花初开时，花药暗褐色，雌蕊区域光滑，雌蕊缺失。侵染发生在花冠出现之前或者之后的短时间内，在花蕾开放后很快结束。被严重侵染的花，在开花前花药和雌蕊都被破坏，当花蕾隆起花瓣可见时，花瓣外可见褐色的损伤，花瓣区域初期呈粉红色，后颜色逐渐变深为黑色，花心变黑，类似于冻害症状。

２．１．３果实症状侵染初期发病果实病部变褐，变硬。成熟果实变软，表面有白色稀疏菌丝体。果实表现不同程度的畸形。

２．１．４植株症状植株长势较差、矮化，产果小且少。叶片面积变小，单片或多片叶可能萎蔫、退色甚至死亡。严重时，整个植株死亡。

２．２形态观察

在随机选取的根、花和果实的分离物中，在显微镜下均观察到了典型的草莓花枯病原真菌的形态特征。菌丝细胞有双核，菌丝初无色，宽３～９ μｍ，无锁状连接，老熟后呈褐色，在分支处缢缩。在培养基上，很少产生菌核，菌核表面粗糙，褐色至黑色，表里颜色相同，菌核之间有丝状体相连，不产生无性孢子，可产生大量的念珠形孢子链。担子果（子实体）平展、薄、白色。担子为椭球状至近似棒状，（９～１４）μｍ×（８～１２）μｍ，有４个孢子梗。担孢子为椭球状和近似纺锤状，（６～１１）μｍ×（４～６）μｍ。因此，可初步判定这些样品携带了该病原真菌。

２．３致病性测试

草莓种子在３％的ＮａＣｌＯ溶液表面消毒１ ｈ，并在无菌水中浸泡过夜，播种于无菌的含土填充物的塑料钵中，用塑料布封盖，置于连续光照下，待幼苗长出２片真叶时进行病原真菌的接种试验。阳性的致病性分离物在ＰＤＡ平板（含２５０ μｇ／ｍＬ氯霉素）上培养２ ｄ，用打孔器在菌丝生长最旺盛的边缘各取若干个直径为２ ｍｍ的带有菌丝的琼脂碟片，挫伤接种叶片，置于１５～２０ ℃下光照培养，５～８ ｄ后接种点周围出现浅褐色枯死斑，符合草莓花枯病原真菌引发的典型病理学特征。试验还发现，对发病花或根再做病原菌分离，该分离物仍可以观察到与草莓花枯病原真菌一致的形态特征。

２．４ＰＣＲ检测

从感病的叶、花、果实和根部分离的真菌菌丝样品提取总ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增后产物电泳结果显示，所有扩增到的条带都清晰、明亮、大小约６７０ ｂｐ的片段，不见明显的非特异性杂带（图１），符合预期的扩增结果。纯化的ＤＮＡ片段的ＤＮＡ测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ内草莓花枯病原真菌的相关序列有高度的同源性（９９％），证实了ＰＣＲ扩增的结果。

３小结与讨论

草莓花枯病原真菌主要分布于北美洲、欧洲、亚洲，如美国、日本、法国、意大利、巴西等，而在中国目前尚未发现［４－６］。研究表明，它可以通过感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料的远距离运输造成人为的传播［５－７］。我国是草莓种植大国，存在大量的感病寄主，气候和农业条件都适合草莓花枯病菌的生长，一旦该病原菌传入我国将对我国的草莓产业造成巨大的损失。因此，加强口岸检疫措施是防范该病原真菌传入我国的有效途径。

本研究以草莓花枯病原真菌标准菌株１４６９１ＴＭ为出发菌株，建立了以扩增ｒＤＮＡ中ＩＴＳ区域为目标的ＰＣＲ检测体系，其检测结果与传统的生物检测、 鉴定结果一致［６，７］。因此，本研究开发的ＰＣＲ检测技术可以成为草莓花枯病原真菌的常规检测方法，满足口岸检疫的简易、快速的要求。

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