黄花倒水莲内生真菌生物活性评价及HNLF-44菌株鉴定

苏秀丽， 李惠敏， 唐 辉， 李良波, 刘宝玉

( 1. 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所， 广西 桂林 541006； 2. 广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室， 广西 桂林 541006； 3. 广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室， 广西 桂林 541006； 4. 广西中医药大学 药学院， 南宁 530200 )

植物内生真菌是指长期生活在健康植物体内，但在体内生活的这段时间不会引起宿主产生病害的一类真菌(隋丽等，2021)。药用植物内生真菌具有良好的抗氧化活性、抑菌活性等，在农医药行业的活性产物开发中发挥重要作用。研究表明，链格孢属、间座壳属等内生真菌具有良好的抗氧化活性，殷娜等(2022)从药用植物马利筋中发现具有抗氧化活性的链格孢属和间座壳属内生真菌；程庭峰等(2021)从野生麻花艽的一株Cadophorasp.内生真菌Gs-6发酵液中发现槲皮素等黄酮类物质，DPPH清除自由基的IC50为0.039 9 mg⋅mL-1，具有较强的清除活性；寇晓琳等(2020)从青钱柳中发现3株能产生黄酮的链格孢属真菌。此外，镰刀菌属、木霉属等对病原菌具有良好的抑制作用，Zhao等(2020)研究发现1株内生真菌Seimatosporiumsp. M7SB 41能够增强宿主植物抵抗蔷薇白粉病的能力，降低感染蔷薇白粉病的风险。Bucarei等(2019)将一种白僵菌(Beauveriabassiana)定殖在西红柿和辣椒植株根部一段时间后发现，其能够减轻由灰霉病菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病病害发生程度。此外，内生真菌燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)和木霉属(Trichoderma)的康宁木霉(T.koningii)和深绿木霉(T.atroviride)对柑橘青霉病，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和黑曲霉(A.niger)具有良好的防治作用(郭东升等，2020；Erfandoust et al., 2020)。因此，从药用植物内生真菌中获得具有生物活性的次级代谢产物是可行的，药用植物内生真菌次级代谢产物为天然产物的开发提供了强大动力。

黄花倒水莲(Polygalafallax)，别称黄花远志，远志科(Polygalaceae)远志属(Polygala)植物，是一种深受少数民族喜爱的药用植物(翁颖妮等，2020)。其根部富含皂苷、黄酮、多糖类等物质，具有抗衰老、降血糖等多种生物活性(姚志仁等，2020；李根等，2022)。目前，虽然国内外已有许多有关黄花倒水莲化学成分和药理活性的研究，但未曾见到有关黄花倒水莲内生真菌及其次级代谢产物生物活性的研究。有研究表明，从药用植物远志中分离得到的链格孢属内生真菌不仅具有抑菌活性，而且能够产生皂苷类物质、香豆素等抗氧化物质，具有重要的研究价值(王玉君等，2009；付建红和熊东兰，2013)。据此，我们提出黄花倒水莲内生真菌也具有抗氧化活性、抑菌活性的推测。在内生真菌与宿主有着相似活性的基础上，以黄花倒水莲内生真菌为研究对象，以香蕉专化尖孢镰刀菌(Fusariunoxysporunf. sp.cubense)、香蕉具条叶斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、柑橘树脂病菌(Diaporthecitri)、三七根腐病菌(Fusariumoxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、叶点霉菌为指示菌(Phyllostictazingiberi)，评价内生真菌的抑菌效果，并通过测定内生真菌发酵液DPPH清除自由基能力和总还原能力等指标，评价其抗氧化活性，为下一步从高活性菌株中筛选活性化合物奠定基础，也为民族用药黄花倒水莲资源的综合利用提供了另一条途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试菌株 供试21株黄花倒水莲内生真菌：实验室前期于2020年8—11月从广西灵川、湖南永州、云南文山等地采集的野生黄花倒水莲植株中分离得到。

供试植物病原真菌：香蕉专化尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)、茄病镰刀菌(F.solani)、三七根腐病菌(F.oxysporum)、香蕉具条叶斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、叶点霉菌(Phyllostictazingiberi)、柑橘树脂病菌(Diaporthecitri)，由广西大学农学院提供。

1.1.2 培养基 PDA培养基和PDB培养基：购于北京暖溪汇智科技有限公司，前者100 mL的培养基中含有2 g马铃薯淀粉、0.6 g葡萄糖、2 g琼脂；后者100 mL的培养基中含有2 g马铃薯淀粉、0.6 g葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株抑菌活性测定 初筛和复筛过程均采用平板对峙法(杨帆等，2021)，区别在于初筛过程采用五点对峙法，复筛过程采用两点对峙法。将对峙的PDA平板在光照培养箱中静置培养5～7 d后，测量对照组菌落的半径(R)和实验组病原真菌菌落朝内生真菌方向生长的半径(r)，抑菌率取3次重复的平均值。抑菌率(%)=(R-r)/R×100

1.2.2 供试菌株液体发酵培养 将抑菌活性复筛的13株内生真菌在PDA培养基上培养3 ～7 d后，用0.5 cm的无菌打孔器在菌落边缘打取大小一致的菌块，在含有100 mL PDB液体培养基的250 mL锥形瓶中加入菌块3个，于25 ℃，140 r·min-1的恒温摇床中进行培养15 d。培养结束后，利用抽滤的方法将菌丝体和发酵液分开，然后将获得的发酵滤液依次用0.45、0.22 μm滤膜过滤，获得无菌发酵滤液，保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.3 供试菌株抗氧化活性测定 DPPH清除能力和总还原力是评价抗氧化活性的重要指标，参照前人的研究方法(宋新月等，2018；金宏杰等，2019)对1.2.2中的无菌发酵滤液进行DPPH清除能力和总还原力测定。

1.2.4 HNLF-44菌株的鉴定 采用透明胶带法在莱卡显微镜下观察HNLF-44菌株的菌丝体和孢子形态，根据真菌形态对照相关资料对菌株进行初步鉴定。分子鉴定则根据真菌ITS序列的保守性来进行，根据真菌DNA提取试剂盒说明书提取内生真菌HNLF-44的总DNA，以引物ITS1(序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和引物ITS4(序列为TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度，将PCR产物送到上海生物工程有限公司进行测序。对测序结果进行处理，然后将处理好的序列上传到NCBI数据库中进行BLAST比对，寻找与其相似性最高的菌株序列，下载与其相似性最高的几组序列作为参考序列，利用MEGA7.0软件进行序列对齐、邻接法(neighbor-joining)构建HNLF-44菌株的系统发育树，在分支上显示Bootstrap重复1 000次的数值。

2 结果与分析

2.1 供试菌株抑菌活性初筛测定

黄花倒水莲供试菌株抑菌初筛结果如表1所示，供试菌株对6种植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用(图1)。从抑制的病原菌来看，HNLF-7、HNLF-26、HNLF-44、YNLF-32对香蕉专化尖孢镰刀菌的抑制效果较强，其中HNLF-44对香蕉专化尖孢镰刀菌的抑制效果最好，抑菌率为69.3%。除HNLF-9和LCRXY-26对柑橘树脂病菌的抑菌率分别为49.1%和45.9%外，其余菌株的抑菌率均超过50.8%。HNBA-9对香蕉具条叶斑病菌抑制效果最强，抑菌率为69.1%。HNLF-44对三七根腐病菌具有58.9%的抑菌率。LCPH-5对茄病镰刀菌抑制效果最好，抑菌率为59.0%。所有供试菌株均对叶点霉菌具有较强的抑菌效果，抑菌率均超过53.6%。综上表明，HNLF-44对6种植物病原真菌都具有较强的抑菌活性，抑菌率均超过51.3%。

表 1 黄花倒水莲内生真菌初筛抑菌率的测定Table 1 Determination of inhibition rate primary screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 叶点霉菌; B. 茄病镰刀菌; C. 柑橘树脂病菌; D. 香蕉专化尖孢镰刀菌。A. Phyllosticta zingiberi; B. Fusarium solani; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense. 1. LCLF-7; 2. YNLF-32; 3. LCRXY-26; 4. HNLF-10; 5. HNLF-44; 6. LCSY-43; 7. LCPH-1; 8. LCSXY-9. 图 1 供试菌株对病原真菌的抑菌作用Fig. 1 Antifungal activity of endophytic fungi isolated from Polygala fallax

其中，对叶点霉菌的抑制效果最强，为70.7%；其次是对香蕉转化尖孢镰刀菌，抑制率为69.3%；对茄病镰刀菌的抑制效果较弱，抑菌率仅为51.3%。

2.2 内生真菌抑菌活性复筛测定结果

黄花倒水莲供试菌株抑菌活性复筛结果如表2所示，HNLF-5、HNLF-44对6种植物病原真菌的抑制效果比较好，抑菌率在50.3%以上，其余菌株的抑菌效果较差。从抑制的病原菌来看，对香蕉专化尖孢镰刀菌抑制效果最强的是HNLF-44(91.4%)(图2)，其次是HNLF-5(54.0%)。HNLF-44对香蕉具条叶斑病菌的抑制效果最强(67.0%)，其次是HNLF-5(59.4%)。对柑橘树脂病菌、叶点霉菌抑制效果最好的均为HNLF-5，抑菌率分别为73.2%和70.3%；其次是HNLF-44，抑菌率分别为67.7%和67.0%。HNLF-44对三七根腐病菌、茄病镰刀菌的抑制效果最好，抑制能力均达到60.7%以上。

表 2 黄花倒水莲内生真菌复筛抑菌率的测定Table 2 Determination of inhibition rate re-screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 叶点霉菌; B. 香蕉具条叶斑病菌; C. 柑橘树脂病菌; D. 香蕉专化尖孢镰刀菌; E. 茄病镰刀菌; F. 三七根腐病菌。A. Phyllosticta zingiberi; B. Mycosphaerella fijiensis; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense; E. F. solani; F. F. oxysporum.图 2 HNLF-44对6种植物病原真菌的影响Fig. 2 Effects of HNLF-44 on six phytopathogenic fungi

2.3 抗氧化活性分析

内生真菌发酵液的总还原能力测定结果如图3所示，菌株HNLF-26、HNLF-44、HNLF-45、LCPH-9、LCSXY-43、LCRXY-26、LCBA-85、YNLF-32的发酵液还原力的吸光值均大于0.5，其余菌株发酵液的吸光值小于0.4。总还原能力强弱与吸光值大小成正比，由此可知，还原能力最强的菌株是LCBA-85，其次是YNLF-32。

图 3 发酵液总还原力测定Fig. 3 Determination of total reducing power of fermentation broth

内生真菌发酵液清除DPPH自由基的结果如图4所示，DPPH清除率都很高，除HNLF-7的清除率为86.90%外，其余菌株的清除率均达90%以上。DPPH清除率越大，抗氧化能力越强，表明供试内生真菌发酵液中含有清除DPPH自由基的物质，具有较强的抗氧化活性。

图 4 发酵液DPPH清除能力测定Fig. 4 Determination of DPPH scavenging ability of fermentation broth

2.4 HNLF-44的鉴定

对香蕉专化尖孢镰刀菌具有强抑菌活性的HNLF-44菌株进行鉴定。HNLF-44菌株在PDA平板上生长缓慢，菌落边缘不规则，表面有白色绒毛，菌丝上还附有少量的黄色水珠、菌丝易挑取(图5:A)。菌落背面为黄色，产色素，在培养过程中可看到基质由透明色变为黄色(图5:B)。培养10 d后在显微镜下观察可看到菌丝分支有隔，分生孢子呈淡黄色、倒棒状，表面有横隔和纵隔(图5:C, D)，根据形态特点将其鉴定为链格孢属真菌。HNLF-44菌株ITS序列经比对后发现，其ITS序列与Alternariaburnsii(NR136119.1)的相似性为100%，由系统发育树图6可知，HNLF-44菌株与NR136119.1聚在同一个分支上，且可信度为97，结合形态特点，将HNLF-44鉴定为链格孢属真菌。

A. 菌落正面; B. 菌落背面; C. 菌丝体; D. 分生孢子。A. Colony front; B. Colony back; C. Mycelium; D. Conidium.图 5 菌株HNLF-44的菌落及孢子形态Fig. 5 Morphological characteristics of HNLF-44 strain

3 讨论与结论

植物体内具有生物活性的内生真菌是天然产物开发的重要来源，长期生活在药用植物体内的内生真菌会趋于与宿主有一致的生物活性，因此药用植物内生真菌是研究中的重点对象(侯晓强等，2015)。为此我们对黄花倒水莲内生真菌的抗氧化活性和抑菌活性进行了研究，结果发现黄花倒水莲内生真菌不仅具有抑菌活性还具有抗氧化活性，与丹参种子内生真菌具有抑菌活性、抗氧化活性的结果相似(刘玉娇等，2020)，表明黄花倒水莲内生真菌具有可开发利用的基础。

链格孢属内生真菌在拮抗病原菌方面具有良好的作用，能够通过产生一些交链格孢酚、交替那吡酮等物质对生物产生毒害作用，是一种很好的生物资源(Puntscher et al., 2019)。本研究发现，黄花倒水莲的1株链格孢属内生真菌HNLF-44对香蕉专化尖孢镰刀菌、柑橘树脂病菌、叶点霉病菌等具有良好的拮抗活性，特别是对香蕉专化尖孢镰刀菌具有91.4%的拮抗活性。这表明HNLF-44菌株在对峙培养的过程中可能产生了一些对植物病原真菌有害的如交链格孢酚等物质，进而抑制了病原真菌菌丝的生长。本研究结果与现有的链格孢属内生真菌对植物病原真菌具有拮抗活性的研究结果基本一致，周兵等(2011)研究发现链格孢菌的发酵液产物对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、烟草灰霉病菌(Botrytiscinerea)等植物病原真菌具有一定的抑制活性；翟凤艳等(2011)认为茄链格孢菌毒素对小麦赤霉病菌和番茄煤污病菌(Cladosporiumfulvum)的菌丝生长和孢子萌发均具有抑制作用；陈思杰等(2022)发现Alternariaalternata的50%浓度发酵滤液对枸杞根腐病菌(Fusariumoxysporum)的分生孢子抑制率为91.48%，挥发性物质对菌丝生长的抑制率为94.10%；苗智等(2016)从夹竹桃中筛选到1株对白菜黑斑病菌(Cabbageshadinggerms)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)等8种病原菌具有抑制作用的链格孢属真菌SPS-04，从其发酵产物中发现了交链孢酚的存在。此外，链格孢属内生真菌还可以产生与宿主相同或相似的抗氧化活性物质，如黄酮类物质等。李姝诺等(2009)从越橘中发现了一株可以产黄酮化合物的细链格孢菌(Alternariatenuissima)；寇晓琳等(2020)从药用植物青柳的内生真菌中发现了3株能够产生的黄酮类物质的链格孢属内生真菌。因此，我们认为链格孢属真菌HNLF-44菌株具有抗氧化活性的原因可能是其在进行发酵培养的过程中产生了诸如黄酮类的抗氧化活性物质，这表明HNLF-44在与黄花倒水莲长期共存的过程中可能获得了产抗氧化活性物质的能力。因此，后续我们需要对HNLF-44的菌株的次级代谢产物进一步研究，找出其中的抗氧化和抑菌活性物质。

图 6 基于ITS序列构建的HNLF-44菌株的系统进化树Fig. 6 Phylogenetic tree of HNLF-44 strain constructed based on ITS sequence

综上所述，本研究从黄花倒水莲内生真菌中发现的一株链格孢属HNLF-44菌株具有良好的抑菌、抗氧化活性，为后续从HNLF-44菌株中深入挖掘抑菌、抗氧化活性物质奠定了优良基础。