拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得

包曙光， 魏情情， 刘智康， 聂　祥， 门淑珍

( 南开大学 生命科学学院 植物生物学和生态学系， 天津 300071 )



拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得

包曙光， 魏情情， 刘智康， 聂祥， 门淑珍*

( 南开大学 生命科学学院 植物生物学和生态学系， 天津 300071 )

摘要：植物体内的α,β-不饱和活性醛类化合物对植物细胞具有毒害作用，清除这些α,β-不饱和活性醛类化合物对于植物细胞维持正常的生命活动至关重要。前人研究报道通过体外酶活测定和异源瞬时表达鉴定拟南芥At3g04000基因编码的蛋白为NADPH依赖的叶绿体醛还原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs)，推测其在清除叶绿体中长链(≥5)α,β-不饱和醛类物质中具有重要的功能。该研究主要构建了拟南芥At3g04000基因的表达模式分析载体ProAt3g04000:GUS、亚细胞定位分析载体At3g04000-EGFP和过量表达载体At3g04000-OE，并获得了转基因拟南芥，并通过实时定量PCR分析了At3g04000基因在拟南芥不同组织中的转录水平。结果表明：拟南芥At3g04000基因在幼苗中的转录水平最高，在莲座叶、茎生叶、花序和角果中均有较高的转录水平；而在根部和茎秆中的转录水平较低。通过对ProAt3g04000:GUS转基因植株的GUS染色分析可知，At3g04000基因在子叶、莲座叶和萼片的维管组织和保卫细胞中均有较强的表达，在根的维管组织中有较弱的表达。通过共聚焦显微镜对At3g04000-EGFP转基因植株的观察和分析发现，At3g04000不是定位于叶绿体中，而是定位在细胞质和细胞核中。该研究结果为深入研究拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000的功能奠定了基础。

关键词：拟南芥， α,β-不饱和醛， 醛还原酶， At3g04000， 表达模式， 过量表达

活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)是植物有氧代谢过程中重要的副产物，对于植物生长发育过程起双重功效：低浓度ROS可以促进植物的生长发育，高浓度ROS对植物有氧化胁迫作用(Bolwell et al，1995；林植芳和刘楠，2012；田敏等，2005)。正常情况下，植物体内ROS产生和清除处于平衡状态不会对细胞造成伤害。当外在或内在因素破坏了生物体内ROS含量的动态平衡状态时,生物体内过多的ROS将会损伤生物大分子，主要包括对蛋白质的损伤作用、对DNA和糖类的氧化损伤及脂质过氧化(Potikha et al，1999；Halliwell，2006；张文玲等，2000；李冰冰等，2005)。当植物遭受到外界生物或非生物胁迫时，ROS含量会迸发(Jackson et al，2001；Fath et al，2002)。ROS中的单线态氧和羟基自由基能与细胞膜组分中的多聚不饱和脂肪酸发生作用引发脂质的过氧化反应，产生大量含有羰基的中间产物(Burcham，1998)。不饱和羰基化合物会扰乱细胞内的代谢平衡造成氧化胁迫，从而引起对细胞的毒害。其中醛类物质能破坏膜的完整性，引起细胞毒害(Esterbauer et al，1991；Millar & Leaver，2000；Yamauchi & Sugimoto，2010)。活性醛参与了植物逆境胁迫下对细胞的毒害作用，影响植物正常的生长发育(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物体内过多的活性醛类物质将会提高植物抵抗逆境的能力。Chen & Murata(2002)发现甜菜碱乙醛脱氢酶BADH能使细胞在干旱和高盐等逆境胁迫下维持渗透平衡从而提高植物抗逆性。张海玲等(2010)发现转乙醛脱氢酶基因(ALDH)番茄的抗逆性明显高于对照，转基因植物体内的活性醛类物质所造成的氧化胁迫明显下降。Mano et al(2005)在烟草中过量表达拟南芥的2-烯醛还原酶基因(2-ALKENALREDUCTASE，AER)明显减少强光诱导的氧化胁迫，提高植物抗逆性。吴茜等(2015)在烟草中过量表达拟南芥AER基因明显提高了烟草抗旱能力。α,β-不饱和活性醛类物质可以通过与氨基反应形成希夫碱化合物(Schiff baseadducts)，对细胞造成毒害(Yamauchi et al，2008)。因此，去除植物体内α,β-不饱和的活性醛类物质有助于植物解除活性醛造成的氧化损伤。

哺乳动物细胞中去除α,β-不饱和活性醛的代谢途径已有报道(Uchida，2003；Yamauchi et al，2011)，包括(1)醛脱氢酶，氧化醛类物质转变为羧酸盐类化合物(Sellin et al，1991)；(2)醛-酮还原酶，催化醛转变为醇类物质(Kolb et al，1994; Burczynski et al，2001)；(3)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)途径(Hartley et al，1995)；(4)NADPH依赖的链烯基氧化还原酶，催化含有α,β-不饱和的活性醛类物质的氢化作用(Dick et al，2001)。关于植物体内去除不饱和活性醛类物质代谢途径的研究相对较少。Yamauchi et al(2011)在拟南芥中筛选到NADPH 依赖的链烯基氧化还原酶At1g23740。此外，还在拟南芥中分别筛选到NADPH 依赖且定位于细胞质的醛还原酶(At2g24190和At3g61220)和定位于叶绿体的一个醛-酮还原酶(At2g37770)及2个醛还原酶(At1g54870 和At3g04000)。其中，At3g04000具有去除长链(≥5)α,β-不饱和醛和饱和醛的醛还原酶活力，并以紫鸭跖草(Tradescantiareflexa)叶片为材料利用瞬时转化技术鉴定拟南芥醛还原酶At3g04000定位于叶绿体。然而，关于At3g04000表达模式的分析和在拟南芥稳定表达株系中亚细胞定位模式的研究尚未见有报道。本研究通过实时定量PCR检测了At3g04000基因在拟南芥不同组织的转录水平。构建了At3g04000基因的启动子与GUS报告基因的融合载体，并且获得了转基因拟南芥ProAt3g04000:GUS。通过GUS染色分析了拟南芥醛还原酶At3g04000的表达模式。构建了At3g04000全长基因(-927～+933)与GFP基因融合的亚细胞定位分析载体。以At3g04000-EGFP转基因拟南芥作为材料，检测了拟南芥醛还原酶At3g04000在拟南芥体内的亚细胞定位模式。另外，构建了拟南芥醛还原酶At3g04000过量表达载体，并且获得了纯合的过量表达转基因拟南芥。

1材料与方法

1.1 植物材料

所用的拟南芥(Arabidopsisthaliana)为哥伦比亚型(Col-0)，种子由本实验室保存。拟南芥培养在人工气候室内，温度设定为22 ℃，湿度设定为60%，设定光照为16 h、8 h黑暗。分别采集野生型拟南芥的根、幼苗、莲座叶、茎生叶、茎秆、花序和角果用于At3g04000基因表达模式的分析。采集四周龄的野生型和过量表达植株的莲座叶用于过量表达植株的转录水平分析。植物材料采集后立即于液氮中速冻，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和 SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒均购自TaKaRa生物公司。引物订购和测序反应均由华大生物有限公司完成。限制性内切酶购自Thermo公司。其它试剂购自上海生工生物有限公司。

1.3 主要方法

1.3.1 RNA提取和cDNA的合成拟南芥总RNA 的提取按照TaKaRa生物公司RNA提取试剂盒说明书进行。取2 μg不同组织的的总RNA用于反转录反应，合成的cDNA于-20 ℃保存备用。

1.3.2 At3g04000基因的启动子、开放阅读框和全长基因(-927～+933)的克隆通过拟南芥数据库(www.arabidopsis.org)获得At3g04000基因的完整信息。选取起始密码子(ATG)上游927 bp作为该基因的启动子。采用Premer Premier 5.0软件设计At3g04000基因的启动子、开放阅读框和全长基因序列(-927～+933)的特异引物，附加所需的限制性内切酶位点(表1)。以3周龄拟南芥莲座叶的DNA为扩增At3g04000基因启动子和全长基因(-927～+933)的模板。以幼苗总RNA反转录合成的cDNA为扩增At3g04000基因开放阅读框的模板。

1.3.3 表达载体构建和拟南芥转化通过酶切连接的方法分别构建了At3g04000表达模式分析载体、亚细胞定位分析载体和基因过量表达载体(图2)。(1)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性内切酶对扩增得到的At3g04000基因的启动子产物和pGreenⅡ-0229-GUS载体进行酶切反应。通过T4连接酶的连接作用将At3g04000基因的启动子序列连接到pGreenⅡ-0229-GUS载体中，获得了At3g04000基因表达模式的分析载体ProAt3g04000:GUS。(2)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性内切酶将扩增得到的At3g04000全长基因(-927～+933)产物和pGreenⅡ-0229-EGFP载体进行酶切反应。通过T4连接酶的连接作用将At3g04000全长基因(-927～+933)连接到pGreenⅡ-0229-EGFP载体中，获得了At3g04000基因亚细胞定位的分析载体At3g04000-EGFP。(3)利用XbaⅠ和SpeⅠ限制性内切酶对扩增得到的At3g04000基因的开放阅读框产物和过量表达载体pBA002分别进行酶切反应。通过T4连接酶的连接作用将At3g04000基因的开放阅读框序列连接到过量表达载体pBA002中，获得了带有CaMV35S启动子的过量表达植物载体At3g04000-OE。

将测序正确的At3g04000基因表达模式分析载体、亚细胞定位分析载体和过量表达载体分别转入农杆菌菌株C58C1中。采用花苞浸泡法将3个表达载体分别转化到拟南芥中。

1.3.4 At3g04000基因过量表达植株转录水平分析提取4周龄的野生型和过量表达植株莲座叶的总RNA且反转录为cDNA。用半定量RT-PCR方法鉴定过量表达植株中At3g04000基因的转录水平。

1.3.5 At3g04000基因表达模式和蛋白质亚细胞定位的分析(1)ProAt3g04000:GUS植株的GUS 染色分析：将ProAt3g04000:GUS转基因植株的不同组织分别置入配置好的GUS 染色液中，37 ℃保温过夜。将染色好的植物组织置于固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)中固定脱色2 h，然后用透明剂进行透明处理。

表 1　本文中用到的引物

注：下划线标识引入的酶切位点。Note: Restriction site is underlined.

将透明好的植物材料置于显微镜下观察和拍照。(2)At3g04000基因的实时定量PCR分析：以拟南芥的不同组织总RNA反转录得到的cDNA作为模板，以持家基因ACTIN2基因为内参，进行实时定量 PCR反应。用Primer Premier 5.0软件设计At3g04000基因的特异引物作为扩增引物(表1)。扩增程序如下：预变性 94 ℃ 2 min; 变性94 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸 72 ℃ 20 s，40个循环。每个反应进行3次技术重复。(3)At3g04000蛋白的亚细胞定位分析：以转基因拟南芥At3g04000-EGFP的T2代幼苗的子叶作为实验材料，置于共聚焦显微镜下观察和拍照。

2结果与分析

2.1 拟南芥At3g04000基因的启动子、开放阅读框和全长基因(-927～+933)的克隆及转基因植株的获得

根据拟南芥数据库中的基因信息，At3g04000基因的开放阅读框为816 bp, 编码了272个氨基酸。以野生型拟南芥的DNA为模板，通过PCR扩增分别获得At3g04000基因的启动子和全长基因(-927～+933)的扩增产物(图1)。以野生型拟南芥幼苗总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增获得At3g04000基因开放阅读框的扩增产物(图1)。用酶切连接的方法分别构建At3g04000基因的表达模式分析载体ProAt3g04000:GUS、亚细胞定位分析载体At3g04000-EGFP和过量表达载体At3g04000-OE(图2：A、B、C)。通过花苞浸泡法分别获得3个表达载体的转基因植株，并利用PCR对所获得的转基因植株进行鉴定，获得了转基因阳性植株(图2：D、E、F)。

图 1　拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000启动子、全长基因(-927～+933)和开放阅读框PCR扩增产物的凝胶电泳结果　M. DNA分子量标准； A. At3g04000启动子的扩增产物； B. At3g04000全长基因(-927～+933)的扩增产物； C. At3g04000基因开放阅读框的扩增产物。Fig. 1　PCR products of promoter,genomic sequences (-927-+933) and open reading frame of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000 analyzed by agarose gel electrophoresis　M. DNA marker; A. PCR products of At3g04000 promoter; B. PCR products of At3g04000 genomic sequence(-927-+933); C. PCR products of At3g04000 open reading frame.

2.2 At3g04000基因表达模式的分析

为检测At3g04000基因的表达模式，分别以野生型拟南芥的根、幼苗、莲座叶、茎生叶、茎秆、花和角果为材料，对拟南芥不同组织中At3g04000基因的表达水平进行实时定量PCR检测。由图3可知，At3g04000基因在所有检测组织中均有表达，但表达水平明显不同。At3g04000基因在幼苗中的表达水平最高，在莲座叶、茎生叶、花序和角果中也均有较高的表达水平；At3g04000基因在茎秆中的表达水平最低，在根中的表达水平也较低(图3)。

为了进一步检测At3g04000基因在不同组织表达的特异性，通过GUS组织化学染色法分析了ProAt3g04000:GUS转基因植株的不同组织中At3g04000基因的表达情况。分别将ProAt3g04000:GUS转基因植株的不同组织材料置于GUS染色液中37 ℃保温过夜。通过显微镜观察发现，ProAt3g04000:GUS转基因植株的幼苗、莲座叶、花序中都有染色。在幼苗的整个子叶中都有强的染色，尤其在维管组织和保卫细胞中，而在根部维管组织中染色较弱；在莲座叶维管组织和保卫细胞中有强的染色；在花序中仅在萼片的维管组织和保卫细胞中有强的染色(图4)。

2.3 At3g04000蛋白亚细胞定位的分析

为了检测At3g04000蛋白的亚细胞定位模式，以At3g04000-EGFP转基因拟南芥幼苗的子叶为材料分析At3g04000的亚细胞定位模式。通过共聚焦显微镜观察可知，At3g04000并不定位于叶绿体中，而是定位在细胞质和细胞核中(图5)。

2.4 At3g04000基因过量表达植株的获得及相对转录水平分析

为了研究At3g04000基因在拟南芥的生长发育过程中的作用，采用酶切连接的方法构建了At3g04000基因的过量表达载体At3g04000-OE(图2：C)。通过农杆菌介导法将测序正确的过量表达载体转入拟南芥中并获得了At3g04000-OE转基因拟南芥的T1代种子。由于过量表达载体pBA002中有除草剂抗性基因，因此采用除草剂筛选获得了T1代抗性植株。通过PCR进行基因型鉴定进一步获得了转基因阳性植株(图2：F)。将不同转基因株系的T2代拟南芥种子播种于土中，用除草剂进行筛选。选择抗性苗与非抗性苗比例为3∶1分离的株系作为继续筛选的材料。通过除草剂的筛选获得了纯合的At3g04000-OE转基因单拷贝株系。为了检验转基因植株中At3g04000转录水平的变化，采用半定量RT-PCR分析了转基因植株中At3g04000的相对转录水平，表明转基因株系At3g04000-OE-1 #、5# 和22 #中At3g04000基因的表达量均明显的高于野生型(图6)。这表明获得的纯合At3g04000-OE-1 #、5 #和22 #株系是At3g04000基因过量表达转基因株系。

3讨论

植物体内的有氧代谢过程会产生活性氧，此外当植物受到外界环境胁迫时也会有活性氧在细胞中大量累积(Asada，1999；Thannickal & Fanburg，2000；薛鑫等，2013)。活性氧的过量积累会造成植物体内脂质的过氧化， 从而引起大量醛的累积(Burcham，1998)。在逆境胁迫下植物体内醛的过量积累是引起植物伤害的重要因素之一(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物体内过量累积的醛类物质有利于解除植物所受到的毒害和提高抗逆性(张海玲等，2010；吴茜等，2015)。植物体内的α,β-不饱和的活性醛是一类对细胞产生毒害的醛类物质(Yamauchi et al，2011)。因此清除植物体内的α,β-不饱和的活性醛有利于解除细胞受到的毒害。Yamauchi et al(2011)通过体外酶活测定实验和瞬时表达技术鉴定了At3g04000是一个NADPH依赖的定位于叶绿体的拟南芥醛还原酶。然而，本研究通过实时定量PCR检测和GUS 染色分析可知：At3g04000基因不仅在拟南芥的子叶、莲座叶和萼片中有表达，而且在根部也有明显的表达。因此推测：At3g04000基因可能并不仅仅定位于叶绿体。

图 2　拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000载体构建示意图和转基因植株PCR鉴定结果　A. 表达模式分析载体构建示意图； B. 亚细胞定位载体构建示意图； C. 过量表达载体的构建示意图； D. ProAt3g04000:GUS转基因拟南芥PCR鉴定结果，1-9、11-14和16#为转基因阳性植株； M: DNA分子量标准； P. 阳性对照; N. 阴性对照； E. At3g04000-EGFP转基因拟南芥PCR鉴定结果，1-6、8-11和13-16为转基因阳性植株; M: DNA分子量标准; P. 阳性对照; N. 阴性对照； F. At3g04000-OE 转基因拟南芥PCR鉴定结果，1-25和27-31#为转基因阳性植株; M. DNA分子量标准; P. 阳性对照; N. 阴性对照。Fig. 2　Schematic diagrams of constructed vector and PCR results of transgenic plants of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000　A. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing expression pattern of the At3g04000 gene; B. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing subcellular of the At3g04000 gene; C. Schematic diagram of the vector for At3g04000 gene overexpression vector. D. PCR results of ProAt3g04000:GUS transgenic Arabidopsis, 1-9, 11-14 and 16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; E. PCR results of At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis, 1-6, 8-11 and 13-16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; F. PCR results of At3g04000-OE transgenic Arabidopsis, 1-25 and 27-31 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control.

图 3　拟南芥At3g04000基因在拟南芥不同组织的表达水平　Fig. 3　Expression levels of At3g04000 gene in various Arabidopsis tissues

本研究主要构建了拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000的表达模式分析载体、亚细胞定位载体和过量表达载体。通过农杆菌介导的转化方法分别获得了转基因的拟南芥植株。GUS染色分析和实时定量PCR检测的结果都表明At3g04000基因在拟南芥的根部有表达。尽管At3g04000在拟南芥根部表达的水平较低，然而表达模式的分析结果却暗示着At3g04000并不仅仅定位在叶绿体。为了确定At3g04000基因的亚细胞定位，采用酶切连接的方法将At3g04000全长基因(-927～+933)与绿色荧光蛋白(GFP)编码基因融合构建了亚细胞定位表达载体At3g04000-EGFP。以At3g04000-EGFP转基因拟南芥幼苗的子叶作为观察材料分析了At3g04000亚细胞定位模式。本研究表明，At3g04000并不定位于叶绿体中，而是定位于细胞质和细胞核。

Yamauchi et al(2011)是以紫鸭跖草为材料采用瞬时表达技术证明At3g04000定位于叶绿体。他们用于亚细胞定位的表达载体中的启动子为CaMV35S启动子， 而且只选择了At3g04000N 端的124个氨基酸与GFP形成融合蛋白。本研究中用于亚细胞定位分析的载体中的启动子为At3g04000基因的自身启动子，而且采用At3g04000完整蛋白与GFP形成融合蛋白，并以稳定转化的转基因拟南芥作为观察材料。因此，本研究中的亚细胞定位分析结果更具准确性和科学性。本研究表明，At3g04000不是拟南芥叶绿体醛还原酶(AtChlADRs)，而是拟南芥细胞质醛还原酶(ArabidopsisNADPH-dependent cytosolic ADRs, AtCytADRs)。另外，At3g04000定位于细胞核也暗示着该酶可能存在着其它的功能。

图 4　ProAt3g04000:GUS 转基因植株的GUS染色分析　A. 5 d龄幼苗； B. 幼苗子叶的放大图； C. 幼苗子叶的局部放大图，显示保卫细胞； D. 幼苗根部的放大图； E. 3 d龄黑暗培养的幼苗子叶； F. 16 d龄的拟南芥； G. 完全伸展的莲座叶； H. 花序； I. 花。Fig. 4　GUS staining analysis of ProAt3g04000:GUS transgenic plants　A. Five-day-old seedling; B. Magnified figure of seedling cotyledon; C. Magnified figure of seedling cotyledon, highlight the guard cells; D. Magnified figure of seedling root; E. Three-day-old seedling under dark treatment; F. Sixteen-day-old Arabidopsis; G. Fully extended rosette leaf; H. Inflorescence; I. Flower.

图 5　At3g04000的亚细胞定位分析　A. At3g04000-绿色荧光蛋白信号； B. 叶绿体自发荧光信号； C. A和B图叠加后图像。Fig. 5　Aanlysis on subcellular localization of At3g04000 protein　A. Green fluorescence protein signal; B. Auto-fluorescence signal of chloroplast; C. Merged image.

图 6　At3g04000-OE 转基因植株中At3g04000基因的转录水平分析　At3g04000-OE-1#、5# 和22#为At3g04000的过量表达株系；ACTIN2作为内参基因。Fig. 6　Transcription levels of At3g04000 gene　At3g04000-OE-1#, 5# and 22# were overexpression lines of At3g04000. ACTIN2 gene was used as housekeeping gene.

为了更深入研究At3g04000的功能，本研究虽获得了纯合的At3g04000过量表达转基因拟南芥，但在正常生长条件下过量表达植株与野生型相比未展现出明显的区别。对于拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000的功能分析还需要进一步研究才能掌握该基因在植物抗逆中的作用。本文为进一步研究拟南芥醛还原酶在植物抗逆中的功能奠定了基础。

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Expression pattern analysis ofArabidopsisaldehyde reductase encoding gene At3g04000 and generation of overexpression plants

BAO Shu-Guang, WEI Qing-Qing, LIU Zhi-Kang, NIE Xiang, MEN Shu-Zhen*

(DepartmentofPlantBiologyandEcology,CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity, Tianjin 300071, China )

Abstract:Reactive aldehyde, especially α,β-unsaturated aldehyde compounds are toxic to plant cells. Therefore, elimination of α,β-unsaturated aldehyde compounds is vital for plant cells to maintain normal life activities. In previous reports, the Arabidopsis At3g04000 gene was identified as encoding a NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases (AtChlADRs) by enzyme activity assay in vitro and subcellular localization analyse in spiderwort cells. And it was proposed to play important role in scavenging α,β-unsaturated aldehydes with more than 5 carbons (C≥5) in chloroplasts. To further analysis the roles of At3g04000 gene, we generated transgenic Arabidopsis plants expressing a ProAt3g04000:GUS for analysis of its expression pattern, a At3g04000-EGFP translational fusion for subcellular localization analysis, and 35S:At3g04000 for overexpression of At3g04000 gene. We also used quantitative real time PCR to investigate the transcription of At3g04000 gene during the developmental process of Arabidopsis. The results showed that the transcription of At3g04000 gene was detected in all examined tissues. The highest transcription level of At3g04000 gene was detected in Arabidopsis seedlings, relative high level of At3g04000 gene transcripts were also detected in rosette leaf, cauline leaf, inflorescence and silique, while in root and stem the transcription level of At3g04000 gene was very weak. The results of GUS staining in ProAt3g04000: GUS transgenic Arabidopsis plants were in consistency with the results of the quantitative real time PCR analysis. Strong GUS staining was found in vascular tissues and guard cells of cotyledon, rosette leaf and sepal, and weak GUS staining was found in vascular tissues of root. To analyze the subcellular localization of the At3g04000 gene encoded protein, the At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis seedling was observed by confocal microscopy. The results showed that At3g04000 gene encoded protein was not localized in chloroplast, but localized in cytoplasm and nucleus. This study provides tools for further study of the roles of At3g04000 gene in Arabidopsis.

Key words:Arabidopsis, α,β-unsaturated aldehyde, aldehyde reductase, At3g04000, expression pattern, overexpression

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201601028

收稿日期:2016-01-18修回日期：2016-03-04

基金项目：国家自然科学基金(31570247, 91417308, 91017009, 31460453)；天津市自然科学基金(12JCZDJC23200)；国家基础学科人才培养基金南开大学生物学人才培养基地(J1103503) [Supported by the National Science Foundation of China (31570247, 91417308, 91017009, 31460453); the Natural Science Foundation of Tianjin (12JCZDJC23200); Funds for National Basic Science Personnel Training (J1103503)]。

作者简介：包曙光(1985-)，男(蒙古族)，内蒙古通辽市人，博士研究生，主要从事植物分子生物学研究，(E-mail) mindaguang3906@126.com。 *通讯作者：门淑珍，博士，教授，博士生导师，主要从事植物固醇的研究，(E-mail) shuzhenmen@nankai.edu.cn。

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142(2016)06-0698-09

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