鸭儿芹的化学成分及对Hep G2细胞毒性

刘安韬 张婷 梁杏梅

摘 要：该研究采用大孔树脂（D101）、硅胶、羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）和十八烷基硅烷键合硅胶 （ODS）等色谱方法，对鸭儿芹的化学成分进行了分离纯化，根据理化性质、质谱和核磁共振波谱数据，并参考相关文献综合分析化合物结构，进而采用噻唑蓝（MTT）法，对鸭儿芹化合物抗Hep G2细胞活性进行筛选。结果表明：共从鸭儿芹中分离鉴定了7个化合物，分别为p-（acetylamino）phenol（1），辛酸甲酯（2），丁酸异戊酯（3），N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺（4），5-羟基-1-（4-羟基-3-甲氧苯基）庚3酮（5），3，5二丁基六氢吡咯里嗪（6），（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate（7）。其中，化合物6对细胞具有抑制作用，抑制率达到89.1%。该研究结果表明化合物1-7均为首次从鸭儿芹中分离得到，其中化合物6对Hep G2细胞的生长具有抑制作用，且具有剂量依赖性。

关键词：鸭儿芹， 化合物， 抗肿瘤活性

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）04-0469-06

Abstract：Chemical constituents of Cryptotaenia japonica were separated and purified by macroporous resin D101， silica gel chromatography， Sephadex LH-20 and octadecylisilyl（ODS）. Component structures were identified by physical and chemical properties， using spectral analysis included MS and NMR. MTT method was used to evaluate anti-tumor activities of chemical components. The results were as follows：Seven constituents were obtained from C. japonica. The structures were identified as p-（acetylamino）phenol（1）， methyl caprylate（2），isopentyl butyrate（3）， N，N-dimethyl-1H-benzo [d]imidazol-2-amine（4），5-hydroxy-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）heptan-3-one（5），（3R*，5S*，7aR）-3，5-dibutylhexahydro-1H-pyrrolizine（6）， （S）-4-（1-hydroxy-allyl）phenyl acetate（7）. Componds 1-7 were obtained for the first time from C. japonic. Component 6 showed significant inhibitory effect against Hep G2 with the inhibition ratio 89.1% and had dose-dependent effect.

Key words：Cryptotaenia japonica， compond， anti-tumor activity

鴨儿芹（Cryptotaenia japonica）为伞形科植物鸭儿芹的全草，又名三叶芹、鸭脚板草、野芹菜等。在全国各地均有广泛的分布（中国科学院植物研究所，1985）。鸭儿芹具有消炎解毒、活血消肿的功效，主治肺炎、肺脓肿、淋病、感冒咳嗽、跌打损伤，外用治皮肤瘙痒等病症（江苏新医学院，1977）。鸭儿芹中含有黄酮类化合物（李长生等，2006；李胜华和牛友芽，2012）和挥发油类成分（江丰等，2006），挥发性萜类化合物，占总挥发性成分的82.37%（瞿万云等，2003）。鸭儿芹提取物有着较广泛的药理活性，实验结果表明其具有清咽（高敏等，2005），保肝降酶等作用（田琳和龚其海，2008；李娟等，2012）。

本研究运用大孔树脂（D101），硅胶，羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20），十八烷基硅烷键合硅胶 （ODS）等色谱方法，对鸭儿芹的化学成分进行分离纯化，从中分离鉴定了7个化合物，分别为p-（acetylamino）phenol（1），辛酸甲酯（2），丁酸异戊酯（3），N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺（4），5-羟基-1-（4-羟基-3-甲氧苯基）庚3酮（5），3，5二丁基六氢吡咯里嗪（6），（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate（7）。化合物1-7均为首次从鸭儿芹中分离得到，进而采用四氯唑盐还原（MTT）法，对鸭儿芹的化合物抗Hep G2细胞活性进行筛选，化合物6对细胞具有抑制作用，且具有剂量依赖性。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

R3型旋转蒸发仪（瑞士步琪有限公司），AV-400 型核磁共振光谱仪（德国 Bruker公司），1100 Series LC/MSD Trap质谱仪（美国Agilent 公司），XR6A型显微熔点仪（上海光学仪器一厂），Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司），薄层色谱硅胶预涂板（青岛裕民源硅胶试剂厂），ODS（80Bin，YMC，日本Merck公司），柱色谱硅胶（80～100，300～400目，青岛裕民源硅胶试剂厂），MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞公司），CJ-1F型医用净化工作台（苏州冯氏实验动物设备有限公司），3111 型CO2培养箱（美国热电（赛默飞世尔）公司），台式离心机（北京时代北利离心机有限公司），DMIL倒置显微镜（德国 Leica）。

人肝癌细胞株Hep G2，购自中国典型培养物保藏中心。

培养瓶和培养板购自Corning公司。噻唑蓝（3- [4，5-dimethylthiazol-2yl]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide， MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；青霉素、 链霉素购自Invitrogen公司，DMEM 培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购自 Hyclone 公司。鸭儿芹植物样本于2014年3月至2015年5月采自广西桂林雁山区，经广西中医药大学廖月葵高级实验师鉴定为伞形科植物鸭儿芹（Cryptotaenia japonica）。

1.2 方法

1.2.1 提取和分离 首先取鸭儿芹干燥药材粗粉约5 kg，60%乙醇加热回流提取3次，每次3 h，过滤合并提取液，浓缩，回收乙醇获得浸膏980 g。然后浸膏混悬于水溶液中分别用石油醚，氯仿，醋酸乙酯，正丁醇进行萃取，回收溶剂得到石油醚部分浸膏29.44 g，氯仿部分浸膏48.6 g、乙酸乙酯部分浸膏57.9g、正丁醇部分浸膏230 g。最后水溶液部位过大孔树脂D101，用水洗脱后，用95%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，真空干燥，获得水溶性部分浸膏约535.5 g。

正丁醇部分经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（9∶1、8∶2）甲醇-乙酸乙酯（14∶1、12∶1）洗脱，共分得7个部分，各部分继续用氯仿-甲醇为流动相硅胶柱色谱分离，经反复Sephadex LH-20柱色谱、ODS柱色谱分离纯化得到化合物1（43.1 mg）。

乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱分离，氯仿-乙酸乙酯（50∶1、10∶1、1∶1），氯仿-甲醇（10∶1、1∶1）乙酸乙酯-甲醇（1∶5、1∶1）洗脱，共分成8个部分，其中1～5部分经反复Sephadex LH-20柱色谱，ODS柱色谱分离纯化得到化合物2（50 mg）、化合物3（17.5 mg）、化合物4（95 mg）、化合物5（51 mg）、化合物6（61.8 mg）、化合物7（9 mg）。

1.2.2 抗肿瘤活性实验 细胞株用含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d换一次液， 用0.25%胰蛋白酶消化传代。在Leica显微镜下观察加藥前后细胞形态学变化。

取对数生长期的肿瘤细胞，制成 2×104～3×104个·mL-1单细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔200 μL，每组设3个平行孔，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后分别加入不同浓度的样品。另设阴性对照组，继续培养72 h。实验终止前4 h，每孔加入浓度为1 mg·mL-1的MTT 50 μL， 4～6 h后，弃去培养液，每孔加DMSO 100 μL，震荡5 min，待结晶溶解后用酶标仪于570 nm波长测定OD值。按公式计算肿瘤细胞抑制率：抑制率（Inhibitory Rate，IR%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%，用SPSS 18.0，计算抑制50%细胞生长的样品浓度，以IC50表示。

2 结构鉴定与抗肿瘤活性测试

2.1 结构鉴定 图1

化合物1 白色结晶。FAB-MS m/z：167.16，分子式为C8H9NO3。1H-NMR （600 MHz，CD3OD） δ：3.68 （3H， s，-OCH3），7.38（2H，dd，J=7.5，1.5Hz，H-3，5），6.73（2H，dd，H-2，4），9.97（1H，s，H-NH），9.94（1H，s，-OH）。13C-NMR （600MHz，CD3OD） δ：172.87（C=O），131.4（C- 4），116.70 （C-2，C-4），124.54 （C-3，C-5），154.8（C-5），23.84（-OCH3）。以上数据与Lewis et al（2003）报道一致，推断化合物1为p-（acetylamino）phenol。

化合物2 白色脂肪状。FAB-MS m/z：15813，分子式为C9H18O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：0.88（3H，d，J=8.0Hz，H-1），1.26（2H，dd，J=7.1，8.0Hz，H-2），1.26（2H，s，J=7.1Hz，H-3），1.26（2H，dd，J=7.1Hz，H-4），1.33（1H，s，J=7.1Hz，H-5），1.66（2H，s，H-6），2.32（2H，dd，H-7），3.61（3H，s，H-OCH3）。13C-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：13.28（C-1），22.39（C-2），31.7（C-3），28.82（C-4，5），24.67（C-6），33.61（C-7），78.05（C-8），50.94（C-OCH3），174.4（C=O）。以上数据与Chinta et al（2016）报道一致，推断化合物2为辛酸甲酯。

化合物3 淡黄色粉末。FAB-MS m/z：158.13，分子式为C9H18O2。1H-NMR （600 MHz，CD3OD） δ：0.99（3H，d，J=8.0Hz，H-1），0.97（6H，d，J=8.0Hz，H-8，9），4.13（2H，d，J=7.1Hz，H-3），2.32（1H，d，J=7.1Hz，H-5），1.81（1H，m，H-7），1.68（2H，m，H-2），1.52（2H，m，H-6）。13C-NMR （600MHz，CD3OD）δ：13.09（C-1），28.81（C-8，C-9），22.32（C-2），33.66（C-5），31.64（C-3），24.7（C-7），176.71（C-4），115.58（C-6），175.0（C=O）。以上数据推断，故鉴定化合物3为丁酸异戊酯。

化合物4 淡黄色粉末。FAB-MS m/z：161.1，分子式为C9H11N3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：12.40（1H，s，J=8.0Hz，H-2），3.06（6H，s，H-CH3），7.12（4H，d，J=7.5，1.5Hz，H-4，5，6，7）。13C-NMR （600MHz，CD3OD）δ：170.13（C-2），153.28 （C-4a），130.27（C-7a），122.1（C-6），122.4（C-7），114.84（C-4），22.12（C-CH3），22.12（C-CH3）。以上数据与Benassi et al（2010）报道一致，鉴定化合物4为N，N-二甲基-苯并咪唑-2胺。

化合物5 淡黄色油滴。FAB-MS m/z：252.14，分子式为C14H20O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD） δ：9.96（1H，s，J=8.0Hz，H-4′-OH），6.77（1H，s，H-5-OH），6.59（1H，d，J=8.5Hz，H-6′），6.64（2，dd，J=8.5，1.5Hz，H-5′），6.78（1H，d，J=1.5Hz，H-2′），3.72（1H，m，J=7.0Hz，H-5），3.77（3H，s，H-3′-OCH3），2.80（2H，d，H-2），2.71（2H，m，H-4），2.78（2H，d，H-1），1.46（2H，m，H-6），0.89（3H，d，H-7）。13C-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：28.96（C-1），31.87（C-2），178.44（C-3），33.88（C-4），73.32（C-5），29.56（C-6），14.12（C-7），133.09（C-1′），113.21（C-2′），150.50（C-3′），171.33（C-4′），116.46（C-5′），121.98（C-6′），37.26（C-OCH3）。 从以上数据推断， 故鉴定化合物5为5-羟基-1-（4-羟基-3-甲氧苯基）庚3酮。

化合物6 淡黄色粉末。FAB-MS m/z：224.23，分子式为C15H29N。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.25（2H，m，J=8.0Hz，H-3，5），2.25（1H，m，H-8），1.66（4H，m，H-1，2，6，7），1.41（4H，m，H-1，2，6，7），1.31（4H，m，H-9，9′），1.25（4H，m，H-10，10′），1.31（4H，m，H-11，11′），0.88（6H，m，H-12，12′）。13C-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：29.07（C-1，7），29.25（C-2，6），31.94（C-3，5），33.94（C-8），29.60（C-9，9′），29.69（C-10，10′），24.70（C-11，11′），22.7（C-12，12′），14.13（C-13，13′）。从以上数据推断，故鉴定化合物6为（3R，5S，7ar）-3，5-dibutylhexahydro-1H-pyrrolizine（3，5二丁基六氢吡咯里嗪）。

化合物7 淡白色结晶。FAB-MS m/z：192.08，分子式为C11H12O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.12（1H，s，J=8.0Hz，H-7-OH），7.21（2H，d，J=8.2Hz H-2，6），7.28（2H，d，J=8.2 Hz H-3，5），5.56（1H，d，H-7），2.31（3H，s，H-CH3），6.30（1H，d，J=12.2Hz，H-8），5.00（1H，d，J=12.2Hz ，H-9），4.99（1H，m，H-9）。13C-NMR（600MHz，CD3OD）δ：121.97（C-1），78.10（C-2，6），78.10（C-3，5），114.82（C-4），77.58（C-7），114.82 （C-8），77.84（C-9），169.95（C-CO），22.2（C-CH3），以上数据推断，故鉴定化合物7为（S）-4-（1-hydroxyallyl）phenyl acetate。

2.2 抗肿瘤活性测试

细胞药理筛选结果（表1）表明，在7个化合物中，其中化合物6对细胞生长具有抑制作用， 抑制率达到89.1%，可以使Hep G2细胞皱缩变圆，细胞密度明显降低，细胞碎片增多，部分细胞出现空泡样变，并且具有剂量依赖性。IC50浓度为（52.31±4.77）μg·mL-1，在得到的所有化合物中对肝癌细胞的抑制作用最为明显。

3 討论与结论

通过对鸭儿芹化学成分进行提取分离和结构鉴定，确证7个化合物的化学结构，均为首次从鸭儿芹植物中分离得到的。化合物6对细胞生长具有抑制作用，抑制率达到89.1%，可以使Hep G2 细胞皱缩变圆，细胞密度明显降低，细胞碎片增多，部分细胞出现空泡样变，并且具有剂量依赖性。 IC50浓度为（52.31±4.77）μg·mL-1，在得到的所有化合物中对肝癌细胞的抑制作用最为明显。

化合物6为双吡咯分子的杂环化合物，该类结构（颜文革和张守芳，2000）首先发现于吡咯里西啶生物碱分子中，该类化合物在新药开发上是一个相当活跃的研究领域，相信化合物6为先导化合物进行结构优化和修饰，可能发现新的具有抗癌作用的药物。

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