鸭梨PAL基因的反义遗传转化及表达分析

李会宣 许冬倩 闫洪波

摘 要：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL，EC4.3.1.5）是植物通过苯丙烷代谢途径合成木质素的关键酶和限速酶，其通过影响木质素的合成而与果实中石细胞的分化、发育及果实品质密切相关。为了降低鸭梨中苯丙氨酸解氨酶的含量，该研究利用反义PAL基因遗传转化鸭梨、降低鸭梨内源PAL基因的表达。结果表明：（1）采用RT-PCR技术，利用根据GenBank中西洋梨PAL基因序列设计特异性引物，扩增得到496 bp的鸭梨PAL基因片段。（2）将扩增片段反向插入载体pBI121的MCS区域，构建植物PAL基因反义表达载体pBI121-AsPAL。接着采用电转化法将反义表达载体转入农杆菌EHA105中，并制备出农杆菌工程菌液。（3）利用农杆菌介导法对鸭梨组培苗叶片外植体进行遗传转化，得到23株转基因鸭梨苗。PCR检测证实PAL反义基因片段转入鸭梨中，实时定量PCR检测表明转基因鸭梨苗体内PAL基因表达量均有所降低，为非转基因苗的65%～75%。该研究结果表明利用反义RNA技术获得了抑制内源性PAL基因表达的转基因鸭梨植株，为改善鸭梨果实品质、改良品种奠定了基础。

关键词：鸭梨， 苯丙氨酸解氨酶， 反义RNA， 遗传转化， 基因表达

中图分类号：Q943.2， S772.3， S661.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）04-0492-09

Abstract：Phenylalanine ammonia-lyase （PAL，EC4.3.1.5） catalyzes the first step from precursors to synthesizing lignin in phenylpropanoid pathway. Lignin accumulation is correlated with stone cell differentiation and fruit quality. In order to reduce the content of PAL， the antisense PAL gene transformed into Pyrus bretschneideri was used to reduce the expression of endogenous PAL gene in P. bretschneideri. According to pear PAL gene sequences in GenBank， a pair of primers were designed， and a 496 bp partial PAL gene fragment was amplified by RT-PCR. The PAL antisense expression vector pBI121-AsPAL was constructed by reverse inserting PAL gene fragment into pBI121 MCS region. The pBI121-AsPAL was transduced into Agrobacterium EHA105 by electro transformation method. Then， pBI121-AsPAL was transformed into tissue cultured P. bretschneideri plants mediated by Agrobacterium. Twenty-three transgenic lines harboring the anti-sense PAL fragment were verified by PCR. The Real-time PCR results showed that the expression level of endogenous PAL gene in transgenic plants was lower than that of non transgenic pear，with amount of non transgenic pear 65%-75%. The results showed that with transformation mediated by Agrobacterium， the expression of endogenous PAL gene was specifically inhibited in antisense RNA transgenic P. bretschneideri seedlings. Therefore， this study provides reference for improvement of the pear fruit quality and species.

Key words：Pyrus bretschneideri， phenylalanine ammonia-lyase， antisense RNA， genetic transformation， gene expression

鴨梨（Pyrus bretschneideri）作为中国的白梨品种，味甜多汁，香气浓郁，营养丰富。梨果肉中的石细胞团严重影响了梨果实的食用品质（田路明等，2011；吕芮宏等，2011）。木质素作为石细胞的主要成分，其合成是从苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸开始的（Kumar & Ellis，2001）。梨果实中的PAL首先参与木质素单体的合成，然后在过氧化物酶的作用下聚合成为木质素，进而为石细胞的形成提供原料（Vanholme et al，2010）。因此，PAL为木质素合成的第一个关键酶（Huang et al，2010），酶蛋白的合成与沉积以及酶蛋白的活性与石细胞的发育密切相关。

以往的研究主要集中在控制植物果实中PAL的活性，以期影响木质素的含量、石细胞的形成，进而影响果实品质。王斌等（2013）和刘艳等（2011）的研究就发现梨石细胞含量与果实中PAL活性呈现极其显著的正相关关系，果实套袋能够降低PAL的活性，导致木质素的合成减少、果实中石细胞的含量降低。邹丽红和张玉星（2012）对砂梨的研究也表明通过果实套袋抑制PAL活性，可以减低石细胞的含量、密度和大小，在一定程度上改进了果品的品质。物理方法虽然抑制了PAL的活性、降低木质素的含量和石细胞的形成，但在改善果品品质方面的作用有限。近年来，根癌农杆菌介导的遗传转化实现了对植物的遗传改造，为进一步改善植物果实或种质品质奠定了基础（陈晓艳等，2017；简兴等，2015）。随着对鸭梨PAL基因结构、表达特性等方面研究的不断深入（刘志浩等，2011；闫洪波等，2014），以及利用反义RNA技术抑制鸭梨多酚氧化酶、果胶甲酯酶及ACC氧化酶等基因的表达也有了成功先例（李桂琴等，2010；李会宣等，2014；齐靖等，2014），这些为利用反义RNA技术降低内源性鸭梨PAL基因的表达水平，减少活性PAL的合成提供了理论参考和实验经验。基于此，本研究通过构建鸭梨PAL基因的反义表达载体，利用农杆菌介导法转化鸭梨组培苗，以期获得转化反义PAL基因片段的鸭梨，为获得PAL基因表达水平降低的转基因植株、研究PAL在鸭梨中的作用以及为选育石细胞含量少的优质鸭梨品种提供参考，进而为改良品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：鸭梨，河北省农林科学院梨园栽植。载体和菌株：pUCm-T vector和大肠杆菌Top10购自上海生物工程公司，pBI121和根癌农杆菌EHA105由本室保存。

试剂：Taq PCR Master Mix、Sac I和Xba I限制性内切酶、氨苄青霉素（Amp）、链霉素（Str）、卡那霉素（Kan）、羧苄青霉素（Carb）、T4DNA ligase、连接试剂盒、IPTG、X-gal、Trizol试剂购自上海生物工程公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、cDNA合成试剂盒购自天根生化科技有限公司； Primescript RT Reagent试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自宝生物工程公司；测序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank公布的苯丙氨酸解氨酶基因PAL CDS序列（DQ901399.1）的核心区，利用Oligo 6.0软件设计上游引物FP1（5′-TTGAGCTCCAATTCCTTGGCAACCCT-3′）和下游引物RP1（5′-GCTCTAGAATAGGGTTTTCAGTTCCTCCTCAAA-3′），粗体部引入的Sac I和Xba I酶切位点。

1.2.2 目的基因的克隆和测序 利用Trizol法提取鸭梨叶片总RNA，反转录成cDNA。

PCR扩增：以cDNA作为模板进行PCR，扩增PAL基因片段。反应体系20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件：95 ℃ 预变性3 min，95 ℃ 变性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，循环30次，最后72 ℃ 保温10 min。

扩增产物的回收、与载体连接、转化及鉴定：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化，纯化产物与pUCm-T Vector连接。连接体系10 μL：PCR纯化产物6 μL ，T4 DNA ligase 1 μL，10×T4 DNA Ligation buffer 1 μL，pUCm-T Vector 1 μL，50% PEG-4 000 1 μL。连接物采用热激法转化E.coli Top10感受态细胞，利用蓝白斑法筛选阳性菌落，提取质粒并进行Sac I和Xba I双酶切鉴定。10 μL的酶切体系：质粒DNA 6 μL，Sac I 1 μL，Xba I 1 μL，10×buffer M 1 μL。重组质粒酶切鉴定后送交上海生物工程公司测序，并命名为pUCm-T-AsPAL。

1.2.3 反义PAL基因植物表达载体的构建及鉴定 将重组质粒pUCm-T-PAL以及植物表达载体pBI121进行Xba I/Sac I雙酶切，回收目的片段并进行连接，由于pBI121中Sac I的酶切位点在下游，Xba I的酶切位点在上游，使得PAL基因片段反向与pBI121连接。连接物转化E.coli Top10，PCR筛选阳性克隆，所用引物FP2（5′-TCTTTCGGCAATAGGGTTTTCAGT-3′）和RP2（5′-CAATTCCTTGGCAACCCTGTCA-3′）根据反向PAL基因片段设计。对PCR鉴定含有反向PAL基因片段的菌落，进一步培养、提取质粒，使用Xba I/Sac I酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pBI121-AsPAL。

1.3 反义PAL基因植物表达载体转化农杆菌EHA105

1.3.1 农杆菌感受态细胞的制备 保存的农杆菌EHA105进行划线分离，挑取单菌落接种于含Rif（50 mg·L-1）和Str（50 mg·L-1）的LB液体培养基，28 ℃，220 r·min-1震荡过夜培养活化，过夜培养物转接至相同抗生素的LB液体培养基，OD600≈0.6时离心收集菌体，用HEPES溶液和10%甘油洗涤，最后用10%甘油悬浮菌体，分装，-80 ℃保存备用。

1.3.2 反义PAL基因植物表达载体电击法转化农杆菌EHA105感受态细胞 将pBI121-AsPAL与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，电压2 500 V、4.3 ms电击转化。转化后菌液黑暗条件下，28 ℃，在含Kan（50 mg·L-1）、Rif（50 mg·L-1）和Str（50 mg·L-1）抗生素平板上倒置培养2 d。与此同时转化pBI121作为阴性对照。抗性平板上长出的菌落先通过PCR筛选，在培养、提取质粒用Xba I/Sac I酶切鉴定。正确的农杆菌菌株用EHA105-pBI121-AsPAL表示，并用于制备工程菌液。

1.4 鸭梨的遗传转化与转反义PAL基因无菌苗获得

1.4.1 农杆菌工程菌液的制备 在无菌条件下将保存的EHA105-pBI121-AsPAL菌液在含 Kan和Rif的 LB培养基上划线，28 ℃倒置、暗培养。挑取单菌落接种于含同样抗生素的LB液体培养基中，28 ℃、220 r·min-1，过夜培养，培养后的菌液1∶50转接于含同樣抗生素的LB液体培养基中继续振荡培养，直至OD600=0.5～0.6，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮，稀释10倍备用。同样方法制备含pBI121空载体的农杆菌菌液作为对照组工程菌液。

1.4.2 农杆菌转化鸭梨及转基因鸭梨组培苗的获得 利用本室前期建立的再生转化体系对鸭梨外植体进行转化。取苗龄28 d的鸭梨无菌组培苗叶片作为外植体，置于EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液或含pBI121空载体的农杆菌工程菌液中，浸染5 min后，将离体叶片放置于诱导选择培养基（S 30 g·L-1+BA 4.0 g·L-1+IAA 0.3 g·L-1+MS+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8） + Kan 50 mg·L-1）共培养2 d。转入添加200 mg·L-1羧苄青霉素的诱导选择培养基进行杀菌和诱导培养愈伤组织。将愈伤组织转入再生芽选择培养基（S 30 g·L-1+BA 3.0 g·L-1+IAA 0.5 g·L-1+Carb 200 mg·L-1+Kan 50 mg·L-1 MS+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8））诱导抗性不定芽再生。切下4～6 cm的抗性不定芽并置于抗性苗筛选培养基（S 30 g·L-1+1/2MS+IBA 1.0 g·L-1+Agar 4.0 g·L-1 （pH5.8）+Carb 200 mg·L-1+ Kan 20 mg·L-1）上诱导生根、扩繁、并进行检测。

1.4.3 转基因植株的PCR检测 按照TaKaRA公司的基因组提取试剂盒提取转基因鸭梨叶片基因组DNA，使用FP2、RP2引物，利用PCR检测鸭梨抗性植株pBI121中插入的反向PAL基因片段，含pBI121空载体的农杆菌工程菌液侵染外植体后诱导再生的鸭梨苗作为对照。同时，使用NPTII基因序列设计的引物N1（5′-ATGATTAACAAGATGGATTGCA-3′）和N2（5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3′），通过PCR检测pBI121质粒，扩增片段的长度为778 bp。

1.5 转基因植株PAL表达水平检测

采用qRT-PCR检测转基因植株中PAL基因的表达水平。Trizol试剂提取鸭梨叶片总RNA，经过DNase I酶解、消化后，利用宝生物工程公司的Primescript RT Reagent试剂盒反转录为cDNA，作为qRT-PCR模板。利用ABI公司的 PRISM 7 500实时荧光定量PCR系统，按照宝生物公司SYBR Premix Ex TaqTM说明书，两步法完成荧光定量PCR，每个样品进行3次重复：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃ 变性10 s，60 ℃延伸30 s，40个循环。内参为鸭梨actin2基因（GU830958.1），A1（5′-GGACATTCAACCCCTCGTCT-3′）和A2（5′-ATCCTTCTGACCCATACCAACC-3′）作为正、反向引物，转入的反向PAL基因片段使用FP2和RP2作为正、反向引物。反应结束后，数据导入Excel表，根据得到的Ct值，运用Livak 和 Schmitten报道的 2-△△CT方法计算目的PAL基因mRNA相对表达量。使用DPS软件进行差异的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鸭梨PAL基因反义表达载体的构建

2.1.1 鸭梨PAL基因片段的克隆及鉴定 以鸭梨叶片cDNA为模板，用PCR技术扩增PAL基因片段。琼脂糖凝胶电泳检测表明（图1：A），扩增得到约500 bp特异性的单一条带，大小与预期相符。将扩增片段与pUCm-T 载体连接，转化E. coli Top10感受态细胞，提取质粒进行Xba I/Sac I双酶切鉴定。重组质粒双酶切产物包含一个约500 bp小片段和一个约2 800 bp的大片段，而空载pUCm-T载体只有一个约2 800 bp大片段（图1：B）。重组质粒命名为pUCm-T-PAL，送交上海生物工程公司测序进行测序，结果表明插入片段为496 bp，与GenBank中的西洋梨PAL序列（DQ901399.1）的一致性极高（图1：C），因此认定pUCm-T-PAL含有鸭梨PAL基因核心区496 bp的片段。

2.1.2 鸭梨PAL基因反义表达载体pBI121-AsPAL的构建 利用Xba I和Sac I酶切植物表达载体pBI121（切去1.9 kb Gus结构基因，并且保留CaMv35S、Nos等部分），与496 bp的目的PAL基因片段连接，由于Xba I/Sac I在载体和片段上的上、下游位置相反，使得目的PAL基因片段反向与载体pBI121连接。连接产物转化E. coli Top10感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组质粒并进行鉴定。一方面，以引物FP2和RP2（反向PAL基因片段的上、下游引物）对重组质粒进行PCR鉴定，扩增产物电泳（图2：A）。另一方面，通过Xba I/Sac I对重组质粒进行双酶切鉴定，得到约496 bp的特异条带（图2：B）。综上结果表明，PAL基因片段已反向插入植物表达载体pBI121中，鸭梨PAL基因反义表达载体pBI121-AsPAL构建成功。

2.2 农杆菌介导的鸭梨PAL反义基因的遗传转化及鉴定

2.2.1 PAL基因反义表达载体pBI121-AsPAL转化农杆菌及PCR鉴定 用电击法将鸭梨PAL基因反义表达载体pBI121-AsPAL转化农杆菌EHA105细胞，与此同时转化pBI121 作为对照，培养后挑取单菌落用引物FP2和RP2对农杆菌菌落进行PCR鉴定（图3）。图3结果表明，pBI121-AsPAL转入农杆菌EHA105。含pBI121质粒的农杆菌命名为EHA105-pBI121，含反义表达载体pBI121-AsPAL的农杆菌命名为EHA105-pBI121-AsPAL，并作为遗传转化的工程菌液。

2.2.2 转PAL反义基因片段的鸭梨组培苗的获得及PCR检测 参照李桂琴等（2010）构建的鸭梨的遗传转化和再生体系进行鸭梨反义PAL基因的遗传转化。鸭梨叶片外植体经EHA105-pBI121或EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液侵染后，经过再生培养基、再生芽选择培养基、抗性苗筛选培养基培养后，最终获得具有卡那霉素抗性的鸭梨组培苗95株。提取再生的抗性鸭梨苗总DNA，利用擴增NPT II基因序列的特异性引物N1和N2以及PAL基因反向序列的引物FP2和RP2，对抗性鸭梨苗进行PCR鉴定。其中，以pBI121-AsPAL质粒作为PCR的阳性对照，阴性对照为非转基因植株，同时还辅以转pBI121鸭梨苗对照。95株抗性鸭梨苗中，PCR鉴定23株含有反义PAL基因片段，阳性率为24.2%。部分结果如图4所示，抗性鸭梨苗（4-6泳道、10-12泳道）分别扩增得到800 bp和496 bp特异条带，符合NPTII和反向PAL基因片段的预期长度，证明转基因鸭梨苗基因组中含有外源的PAL反向基因，即抗性鸭梨苗为转PAL反义基因再生组培苗。

2.3 转基因鸭梨苗PAL基因表达水平检测

提取转基因鸭梨苗叶片总RNA，利用RT-qPCR方法，以非转基因鸭梨苗作为对照，检测转基因鸭梨苗中PAL基因的表达水平。检测结果表明，通过农杆菌介导的PAL反义基因的遗传转化，与对照组非转基因鸭梨苗（其PAL基因表达量设定为1）相比，23株转基因鸭梨苗中PAL基因表达量都有所降低，分别为对照的65%～75%，其中相对表达量最低的为对照的65.1%、 最高的为对照的75.2%。图5列出了部分转pBI121-AsPAL鸭梨苗和转pBI121鸭梨苗中PAL基因的相对表达量。组1、组2和组3中转pBI121-AsPAL鸭梨苗PAL基因相对表达量，与PAL基因相对表达量设定为1的对照非转基因鸭梨苗相比，分别为68.14%、70.87%和73.20%，均低于1，表明转pBI121-AsPAL鸭梨苗中PAL基因的表达量低于非转基因苗，即转pBI121-AsPAL鸭梨苗中PAL基因的表达受到了抑制；而转化pBI121的鸭梨苗中，PAL基因相对表达量分别为非转基因苗的102.81%、111.21%和101.39%，虽然与PAL基因表达量为1的非转基因苗有所不同，但差异不显著，表明转pBI121鸭梨苗与非转基因鸭梨苗中PAL基因表达没有差异。因此，即转入PAL反义基因的鸭梨苗中内源PAL基因的表达在一定程度上均受到了抑制，发挥抑制作用的是PAL反义基因表达载体pBI121-AsPAL，而非pBI121空载体。

3 讨论与结论

石细胞的主要成分为木质素，由薄壁细胞的细胞壁强烈增厚形成，是影响鸭梨果实品质的重要因素。目前发现的影响梨木质素合成以及石细胞含量、发育的有PPO（李玲等，2011）、PAL（闫洪波等，2014）、F5H（徐超等，2015）、COMT（程敏等，2015）、PbCCoAOMT（王丹阳等，2015）、POD4（李文慧等，2017）基因等，其中PAL是木质素合成的首个关键酶基因。因此，可以通过基因表达调控控制PAL的生成量，调节木质素的代谢，抑制石细胞的形成和发育，从而提高梨果实的口感及经济价值。借助农杆菌介导的反义RNA或RNAi技术，可以特异性调控基因在生物体内的表达。本研究根据西洋梨PAL基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增得到496 bp的PAL基因片段，并连接到植物表达载体pBI121，构建鸭梨PAL基因特异性反义表达载体pBI121-AsPAL。利用电击法将pBI121-AsPAL转入农杆菌EHA105中，制备EHA105-pBI121-AsPAL工程菌液。通过农杆菌介导的遗传转化将pBI121-AsPAL导入鸭梨，最终获得了转化PAL反义基因片段的转基因鸭梨。实时定量PCR对转基因鸭梨的PAL表达分析表明，反义PAL基因的遗传转化降低了鸭梨内源PAL基因的表达，为特异性抑制鸭梨PAL活性奠定了基础，也为应用反义RNA技术改善鸭梨果实品质再次提供理论参考。

在以往对鸭梨PAL基因的研究中发现了两个基因，即家族成员PbPAL1（GU906268.1）和PbPAL2（GU906269.1），与大多数植物一样，均含有一个内含子（闫洪波等，2014）。两个基因编码的蛋白在分子大小、结构、带电荷特性等方面没有明显的差异，但在果实发育期过程中二者的表达量却存在差异，说明PAL不同基因家族成员在果实发育的不同阶段可能发挥着不同的功能（闫洪波等，2014）。本研究根据西洋梨PAL基因设计引物，扩增序列与PbPAL1和PbPAL2序列存在极大差异，推测原因可能是PbPAL1和PbPAL2的CDS区是根据GenBank中苹果EST序列设计的两对引物扩增得到的。虽然，苹果的61个EST-SSR和68个SSR可以定位于梨的连锁图上，证实苹果和梨二者的基因组结构存在保守性，但不同类型基因以及基因的不同区域在进化过程中还存在保守性差异（施泽彬等，2011；韩明丽等，2010）。与本研究一样，刘志浩等（2011）也根据西洋梨PAL基因（DQ901399.1）保守区的序列设计引物，使用鸭梨果实cDNA模板，扩增得到了478 bp的PAL基因cDNA片段（GU355673），虽然与本文中扩增得到的496 bp序列在西洋梨PAL基因序列中的位置有所不同，但二者与西洋梨的PAL基因CDS序列的同源性都达到了99%。因此推测在鸭梨中可能还存在除PbPAL1和PbPAL2以外的基因家族成员，这有待于进一步的研究和证实。通过以上对基因的深入研究，也有待于将鸭梨PAL基因信息应用于遗传转化，基于此，本研究利用反义PAL基因遗传转化鸭梨，为进一步应用于遗传育种奠定基础。

对鸭梨PAL基因家族基因表达水平分析表明，PAL作为合成酚类物质关键酶参与了鸭梨幼果期木质素和石细胞的合成，而且在果实发育过程中PAL基因的表达存在明显差异（闫洪波等，2014）。以往的研究也证实反义RNA技术在转基因鸭梨的愈伤组织以及幼苗中表现出了良好的效果（李会宣等，2014；齐靖等，2014）。本研究中得到的23株转基因鸭梨苗中，PAL基因的表达量均有所降低，为对照的65%～75%不等，达到了利用反义RNA技术抑制基因表达的效果。虽然都表现出了抑制内源基因表达的作用，但转基因鸭梨苗中PAL基因表达降低的幅度不尽相同，可能与环境或植株个体特异性影响基因的表达有关。鸭梨属于木本科植物，营养生长期较长，本研究也只对PAL基因的反义表达载体转化的鸭梨苗进行了证实和鉴定，并未能够对转基因植株各个生长期以及植株各个部位的PAL基因表达情况进行系统检测和研究。因此，后期研究主要针对转基因鸭梨不同时期、不同部位的PAL基因的表达情况的分析，尤其是果实发育期，对PAL基因的表达及PAL的活性进行分析，为开发鸭梨种质资源和提升果品品质提供理论依据。

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